m****m
发帖数: 395 | 1 用饱和硫酸铵沉淀了蛋白，完全去除上清液后，PELLET用BUFFER溶解，先用PIPET轻轻
把PELLET打碎成小碎片，然后在37C超声水槽里超声，最后还是有微小的蛋白碎片怎么
都不溶解，测了OD280=2左右，也不算很浓啊，这个浓度的时候这个蛋白一般都是溶解
的，测了PH也没有问题。请问该如何让蛋白完全溶解阿？ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 Dialyze against your buffer overnight
【在 m****m 的大作中提到】
: 用饱和硫酸铵沉淀了蛋白，完全去除上清液后，PELLET用BUFFER溶解，先用PIPET轻轻
: 把PELLET打碎成小碎片，然后在37C超声水槽里超声，最后还是有微小的蛋白碎片怎么
: 都不溶解，测了OD280=2左右，也不算很浓啊，这个浓度的时候这个蛋白一般都是溶解
: 的，测了PH也没有问题。请问该如何让蛋白完全溶解阿？
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D******9
发帖数: 2665 | 3 yes, you have to remove salt first, I used to dialyze my protein at 4
degree overnight |
m****m
发帖数: 395 | 4 The reason why I didn't dialysis is that my protein is a hydrophobic
membrane protein which is desolved in an expensive detergent. If I dialysis,
the detergent will also go away and my protein will precipitate anyway.
I wonder if there's any other way to concentrate protein except using this
method and centrifuge through a membrane to get rid of the water? The later
is not so efficient, because I see some protein also pass the membrane which
causes loss.
Can we use vaccum dry under low temperatu |
m****m
发帖数: 395 | |
s******y
发帖数: 28562 | 6 这几种方法你都可以试一下。没有哪一个是肯定保险的。
至于说用concentrator会损失蛋白？这个可能是因为你没有选对大小合适
的滤膜。一般来说，滤膜的孔的标定尺寸应该比你的蛋白的真正尺寸小
三倍。比方说30K 的蛋白必须用小于10K MWCO的膜，否则蛋白有可能漏过去。
另外，在dialysis 的时候，你可以在外面的溶液里也放上detergent 啊，
我不明白这个为什么会是问题。而且，一般来说，detergent 在溶液里
会形成微团，所以不会容易的透过滤膜
dialysis,
later
which
【在 m****m 的大作中提到】
: The reason why I didn't dialysis is that my protein is a hydrophobic
: membrane protein which is desolved in an expensive detergent. If I dialysis,
: the detergent will also go away and my protein will precipitate anyway.
: I wonder if there's any other way to concentrate protein except using this
: method and centrifuge through a membrane to get rid of the water? The later
: is not so efficient, because I see some protein also pass the membrane which
: causes loss.
: Can we use vaccum dry under low temperatu
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a****o
发帖数: 1786 | 7 如果已经是纯化的蛋白，就不用硫酸铵了吧，这个主要是分离用的
可以用乙醇或TCA， 不知道会不会好溶，没经验 |
a****o
发帖数: 1786 | 8 看来你是赵本山
【在 s******y 的大作中提到】
: 这几种方法你都可以试一下。没有哪一个是肯定保险的。
: 至于说用concentrator会损失蛋白？这个可能是因为你没有选对大小合适
: 的滤膜。一般来说，滤膜的孔的标定尺寸应该比你的蛋白的真正尺寸小
: 三倍。比方说30K 的蛋白必须用小于10K MWCO的膜，否则蛋白有可能漏过去。
: 另外，在dialysis 的时候，你可以在外面的溶液里也放上detergent 啊，
: 我不明白这个为什么会是问题。而且，一般来说，detergent 在溶液里
: 会形成微团，所以不会容易的透过滤膜
:
: dialysis,
: later
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s******y
发帖数: 28562 | 9 小师弟呵，那个三倍的说法是蛋白生化界人常用的。
因为公司们标定那个MWCO 一般是用直链高分子聚合物来测的。
换算成球型分子就必须比这个大三倍，才能保证球形分子的直径是孔径的
1。5倍左右
【在 a****o 的大作中提到】
: 看来你是赵本山
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a***a
发帖数: 40617 | 10 漏也漏不了多少，我用30k的concentrator试着想分离10k的蛋白（可以想让他
漏过去）
结果发现也就20%能过去。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 小师弟呵，那个三倍的说法是蛋白生化界人常用的。
: 因为公司们标定那个MWCO 一般是用直链高分子聚合物来测的。
: 换算成球型分子就必须比这个大三倍，才能保证球形分子的直径是孔径的
: 1。5倍左右
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s******y
发帖数: 28562 | 11 这个就是这样的，你要想漏过去的反而漏不过去。
不想要漏过去的反而会哗哗的漏掉。
而且，这种concentrator 设计的时候不是为了分离蛋白用的，
像你这种用法，会让很多蛋白会卡在孔里或者粘在膜上，不可能全部漏过去的，
能弄到20%已经不错了，但是如果你测一下上方溶液里的蛋白含量，应该会小于80%
【在 a***a 的大作中提到】
: 漏也漏不了多少，我用30k的concentrator试着想分离10k的蛋白（可以想让他
: 漏过去）
: 结果发现也就20%能过去。。。
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a***a
发帖数: 40617 | 12 这个本底损失我当然知道
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个就是这样的，你要想漏过去的反而漏不过去。
: 不想要漏过去的反而会哗哗的漏掉。
: 而且，这种concentrator 设计的时候不是为了分离蛋白用的，
: 像你这种用法，会让很多蛋白会卡在孔里或者粘在膜上，不可能全部漏过去的，
: 能弄到20%已经不错了，但是如果你测一下上方溶液里的蛋白含量，应该会小于80%
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m****m
发帖数: 395 | 13 难道就没有一个既好用又省事的浓缩蛋白的方法吗？可以真空抽吗，弄掉些水分就好阿 |
a***a
发帖数: 40617 | 14 很多做nmr的蛋白的确可以这么折腾。很爽
【在 m****m 的大作中提到】
: 难道就没有一个既好用又省事的浓缩蛋白的方法吗？可以真空抽吗，弄掉些水分就好阿
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s******y
发帖数: 28562 | 15 当然可以，真空抽，保持比较低的温度（10度左右就好）
但是，抽完之后溶液里的盐度会很高的，得dialyze 一次。
或者，你一开始就用比较低盐的溶液的溶解蛋白，然后再抽真空。
【在 m****m 的大作中提到】
: 难道就没有一个既好用又省事的浓缩蛋白的方法吗？可以真空抽吗，弄掉些水分就好阿
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m****m
发帖数: 395 | 16 我想把磷脂蛋白抽干些可以放多点样品到ROTOR里，老板还不同意呢，说水分的多少可
能会影响结构功能。。。
【在 a***a 的大作中提到】
: 很多做nmr的蛋白的确可以这么折腾。很爽
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a******g
发帖数: 71 | 17 我印象中Pierce测定他们的concentrator的MWCO是用的BSA，lysozyme，ubiquitin和
cytochrome C。
【在 s******y 的大作中提到】
: 小师弟呵，那个三倍的说法是蛋白生化界人常用的。
: 因为公司们标定那个MWCO 一般是用直链高分子聚合物来测的。
: 换算成球型分子就必须比这个大三倍，才能保证球形分子的直径是孔径的
: 1。5倍左右
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s******y
发帖数: 28562 | 18 不同的公司做法不一样。这个得看他们的产品说明。
【在 a******g 的大作中提到】
: 我印象中Pierce测定他们的concentrator的MWCO是用的BSA，lysozyme，ubiquitin和
: cytochrome C。
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e****s
发帖数: 1125 | 19 你说的就是冷冻干燥啊，冷冻干燥也有保持蛋白活性和保持活性的问题。而且往往要加
入大量的保护剂，BSA之类的。
研究上还是超滤好。而且Sunnyday说的膜孔3倍分子量以下是很对的。
【在 m****m 的大作中提到】
: 难道就没有一个既好用又省事的浓缩蛋白的方法吗？可以真空抽吗，弄掉些水分就好阿
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l**n
发帖数: 109 | 20 37C超声? 蛋白是不是变性了？
【在 m****m 的大作中提到】
: 用饱和硫酸铵沉淀了蛋白，完全去除上清液后，PELLET用BUFFER溶解，先用PIPET轻轻
: 把PELLET打碎成小碎片，然后在37C超声水槽里超声，最后还是有微小的蛋白碎片怎么
: 都不溶解，测了OD280=2左右，也不算很浓啊，这个浓度的时候这个蛋白一般都是溶解
: 的，测了PH也没有问题。请问该如何让蛋白完全溶解阿？
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