m*******8
发帖数: 256 | 1 最近在做某一蛋白的磷酸化实验，看了几篇文献，都是通过蛋白的迁移来做的。但是他
们在方法里对于跑胶的条件说的都不清楚，所以我想请教达人，胶的浓度，跑电泳的条
件，还有转膜需要注意什么吗？多谢了！ |
I*****y
发帖数: 6402 | 2 run longer with lower voltage and lower percentage of SDS-Page.
If you are using phospho-antibody for your WB, use BSA to block membrane, no
t milk.
【在 m*******8 的大作中提到】
: 最近在做某一蛋白的磷酸化实验，看了几篇文献，都是通过蛋白的迁移来做的。但是他
: 们在方法里对于跑胶的条件说的都不清楚，所以我想请教达人，胶的浓度，跑电泳的条
: 件，还有转膜需要注意什么吗？多谢了！
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J******r
发帖数: 2806 | 3 try phospho-tag
【在 m*******8 的大作中提到】
: 最近在做某一蛋白的磷酸化实验，看了几篇文献，都是通过蛋白的迁移来做的。但是他
: 们在方法里对于跑胶的条件说的都不清楚，所以我想请教达人，胶的浓度，跑电泳的条
: 件，还有转膜需要注意什么吗？多谢了！
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W****7
发帖数: 426 | 4 这个shift实验基本上取决于你的蛋白大小和磷酸化位点的多少，如果蛋白比较大位点
比较少，想用胶迁移率来做太难了。如果非要做的话，就是低点浓度的胶，跑的时间久
一点吧。
你为什么不直接IP出来打质谱呢？或者是用pS pY pT的antibody试试。 |
f*********e
发帖数: 1144 | 5 second this.
就算IP不出来purified form, 也可以稍微纯化一下，然后search 加各种variable
phospho modification mass shifts.
我对western有恐惧，来源于n多年前本科第一次作western试验把整包film曝光了，
develop film的时候手忙脚乱，灌gel 到处漏。。。所以能不做western,尽量不做
western....自己太笨手笨脚了。。。
【在 W****7 的大作中提到】
: 这个shift实验基本上取决于你的蛋白大小和磷酸化位点的多少，如果蛋白比较大位点
: 比较少，想用胶迁移率来做太难了。如果非要做的话，就是低点浓度的胶，跑的时间久
: 一点吧。
: 你为什么不直接IP出来打质谱呢？或者是用pS pY pT的antibody试试。
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m*******8
发帖数: 256 | 6 多谢各位了！今年4,5月打算换实验室，所以就没想着打质谱的事了，搞篇小的就走人
。我们实验室总是慢人半拍，刚想到做点什么，有点苗头了，人那边都已经投了。去年
那篇要不是每天赶着做，差点就歇菜了。今年这篇又是这样，现在赶也来不及了，索性
弄篇小的算了。现在正犹豫到底做什么领域，继续做酵母呢，还是回到以前的哺乳动物
生殖细胞，不知道回国哪个领域好一些？ |
f*********e
发帖数: 1144 | 7 MS很容易，尤其是如果有proteomics core facility, 给点钱让别人做
【在 m*******8 的大作中提到】
: 多谢各位了！今年4,5月打算换实验室，所以就没想着打质谱的事了，搞篇小的就走人
: 。我们实验室总是慢人半拍，刚想到做点什么，有点苗头了，人那边都已经投了。去年
: 那篇要不是每天赶着做，差点就歇菜了。今年这篇又是这样，现在赶也来不及了，索性
: 弄篇小的算了。现在正犹豫到底做什么领域，继续做酵母呢，还是回到以前的哺乳动物
: 生殖细胞，不知道回国哪个领域好一些？
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m*******8
发帖数: 256 | 8 我们所打MUDPIT总是要等3-4个月的，要打的人太多了。 |
f*********e
发帖数: 1144 | 9 。。。那还是自己做western吧
【在 m*******8 的大作中提到】
: 我们所打MUDPIT总是要等3-4个月的，要打的人太多了。
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w*****n
发帖数: 310 | 10 "直接IP出来打质谱"好多reviewer是不信的
【在 W****7 的大作中提到】
: 这个shift实验基本上取决于你的蛋白大小和磷酸化位点的多少，如果蛋白比较大位点
: 比较少，想用胶迁移率来做太难了。如果非要做的话，就是低点浓度的胶，跑的时间久
: 一点吧。
: 你为什么不直接IP出来打质谱呢？或者是用pS pY pT的antibody试试。
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l****y
发帖数: 398 | 11 Mudpit is an overkill for studying one protein. Just cut off the band and
run a normal LC-MS, even Maldi
peptide fingerprinting could work.
of course, WB is a better choice if you can see a shift, because its cheaper
, faster and semi-quantitative.
【在 m*******8 的大作中提到】
: 我们所打MUDPIT总是要等3-4个月的，要打的人太多了。
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