k****o
发帖数: 589 | 1 最近几天用Pierce的Seize X Protein A kit做IP，要沉淀的是一个膜受体。用的抗体
（兔IgG）应该没有问题，因为做WB和flow cytometry都成功。使用了DSS让抗体和
Protein A交联。用了300～400 ug total protein沉淀，4度翻转过夜。之后清洗用的
是自己照着kit说明配的PBS,用kit自带酸性elution buffer洗脱，收集了3个组分。可
是之后用SDS-PAGE+WB检测，受体的带完全没有。我知道这个受体肯定是表达的。请问
可能原因有哪些？
另外Seize X的kit刚好用完，有没有什么其他的kit便宜质量又不错的？曾经考虑过
dynabeads，但是貌似还得另买一台磁力沉淀器？
多谢！ |
g*********5
发帖数: 2533 | 2 western 合适的抗体不一定适合免疫共沉。
可能抗体识别位点在复合体内部。 |
V********n
发帖数: 305 | 3 仅供参考。
可能出的状况
1）不理解为什么要用DSS？交联后抗体是否还有活性需要检测。
2）elution buffer是否能洗脱目标蛋白？建议直接加上样buffer。
3）细胞裂解条件是否合适，IP时的buffer条件是否合适？做IP的细胞裂解条件是否和
之前WB检测时的一致。膜蛋白可能需要比较强烈的buffer条件。但同时，IP的buffer条
件可能不能太极端，需要摸条件。 |
p******i
发帖数: 1092 | 4 你用DSS是因为不想在elution里看到IgG吗？
如果你那个蛋白的size离heavy chain light chain不近，
你先试试不用cross-link做IP好了……
你elution volume是多少？都跑胶了吗？
如果volume大可以concentrate一下，全跑
这个KIT你可以自己order各个试剂，elution buffer也可以找到recipe啊
另外，顶楼上，膜蛋白不好做，搜一搜别人的paper，看用的是什么条件
IP的抗体也要多试几个……
300-400ug有点少啊，多弄点sample啊
【在 k****o 的大作中提到】
: 最近几天用Pierce的Seize X Protein A kit做IP，要沉淀的是一个膜受体。用的抗体
: （兔IgG）应该没有问题，因为做WB和flow cytometry都成功。使用了DSS让抗体和
: Protein A交联。用了300～400 ug total protein沉淀，4度翻转过夜。之后清洗用的
: 是自己照着kit说明配的PBS,用kit自带酸性elution buffer洗脱，收集了3个组分。可
: 是之后用SDS-PAGE+WB检测，受体的带完全没有。我知道这个受体肯定是表达的。请问
: 可能原因有哪些？
: 另外Seize X的kit刚好用完，有没有什么其他的kit便宜质量又不错的？曾经考虑过
: dynabeads，但是貌似还得另买一台磁力沉淀器？
: 多谢！
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k****o
发帖数: 589 | 5
谢谢，我用的抗体是Santa Cruz的，去查了查公司网站，发现是可以用来做IP的。
【在 g*********5 的大作中提到】
: western 合适的抗体不一定适合免疫共沉。
: 可能抗体识别位点在复合体内部。
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k****o
发帖数: 589 | 6
用DSS是为了让抗体不被洗脱，以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性，pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer，用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗？这样即使洗脱，agarose beads也无法重
复用了吧？
【在 V********n 的大作中提到】
: 仅供参考。
: 可能出的状况
: 1）不理解为什么要用DSS？交联后抗体是否还有活性需要检测。
: 2）elution buffer是否能洗脱目标蛋白？建议直接加上样buffer。
: 3）细胞裂解条件是否合适，IP时的buffer条件是否合适？做IP的细胞裂解条件是否和
: 之前WB检测时的一致。膜蛋白可能需要比较强烈的buffer条件。但同时，IP的buffer条
: 件可能不能太极端，需要摸条件。
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k****o
发帖数: 589 | 7
用DSS一是不想看到IgG的带，还有就是当初想重复用agarose beads，因为IP需要的抗
体量太大了，想省钱。
洗脱体积是190 ul，IP前的total protein加了350 ug，洗脱后用了36 ul跑胶。
用那么多蛋白做IP实属无奈，我用的是原代细胞，只有那么多量。
请推荐个浓缩洗脱组分的办法吧，可以的话我打算把剩下的样全跑胶了。
【在 p******i 的大作中提到】
: 你用DSS是因为不想在elution里看到IgG吗？
: 如果你那个蛋白的size离heavy chain light chain不近，
: 你先试试不用cross-link做IP好了……
: 你elution volume是多少？都跑胶了吗？
: 如果volume大可以concentrate一下，全跑
: 这个KIT你可以自己order各个试剂，elution buffer也可以找到recipe啊
: 另外，顶楼上，膜蛋白不好做，搜一搜别人的paper，看用的是什么条件
: IP的抗体也要多试几个……
: 300-400ug有点少啊，多弄点sample啊
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g*********5
发帖数: 2533 | 8 this company....
got good antibodies just like to draw a lottery...
【在 k****o 的大作中提到】
:
: 用DSS一是不想看到IgG的带，还有就是当初想重复用agarose beads，因为IP需要的抗
: 体量太大了，想省钱。
: 洗脱体积是190 ul，IP前的total protein加了350 ug，洗脱后用了36 ul跑胶。
: 用那么多蛋白做IP实属无奈，我用的是原代细胞，只有那么多量。
: 请推荐个浓缩洗脱组分的办法吧，可以的话我打算把剩下的样全跑胶了。
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V********n
发帖数: 305 | 9 个人建议。不要光想着省试剂钱，你的时间也很值钱的。不如用最优化的条件做一遍，
得到正结果后再改进来省银子。几点你可能需要注意。
１）SC的抗体很多不靠谱。当然，也有好的。
２）最好不要用DSS。蛋白交联情况和处理时间有关，结果无法用其他实验验证。如果
是这一步的问题，你都无从查找。
３）低PH洗脱液可以从Agarose上洗脱抗体，但是否能保证打开蛋白－抗体的结合未知
，与多种因素相关。
４）你IP时的缓冲体系是什么，不会是１XCS的裂解液吧。
５）你蛋白上样太少了。直接加小体积上样Buffer煮，全上了做WB。
６）膜蛋白IP不好做。 |
i*****g
发帖数: 11893 | |
p******i
发帖数: 1092 | 11 虽然SC说抗体能IP，建议你最好用自己的sample做个routine的IP+Western试一下。确
定能IP了，再考虑CROSS LINK？
有关重复用agarose beads的问题
1 IP需要多少抗体？没觉得省很多啊……既然用的是原代细胞，你的DISSECTION和
CULTURE的人工费用应该比抗体贵很多吧
2 要确保经过 1和DSS反应 2被ELUTION buffer摧残 后的抗体仍然好用……
浓缩洗脱组分（随便换buffer或者desalt）可以用spin column，
参见
http://www.life.sci.qut.edu.au/epping/LSB607OLT/607concentrator
【在 k****o 的大作中提到】
:
: 用DSS一是不想看到IgG的带，还有就是当初想重复用agarose beads，因为IP需要的抗
: 体量太大了，想省钱。
: 洗脱体积是190 ul，IP前的total protein加了350 ug，洗脱后用了36 ul跑胶。
: 用那么多蛋白做IP实属无奈，我用的是原代细胞，只有那么多量。
: 请推荐个浓缩洗脱组分的办法吧，可以的话我打算把剩下的样全跑胶了。
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k****o
发帖数: 589 | 12 多谢大家帮忙！下次试试不加DSS，浓缩洗脱组分。抗体差不多用完了，也可以换家试
试。 |
k****o
发帖数: 589 | 13
多谢，关于第四个问题，我用的是裂解液和wash/binding buffer (类似PBS) 1：1混合
。有更好的办法吗？
【在 V********n 的大作中提到】
: 个人建议。不要光想着省试剂钱，你的时间也很值钱的。不如用最优化的条件做一遍，
: 得到正结果后再改进来省银子。几点你可能需要注意。
: １）SC的抗体很多不靠谱。当然，也有好的。
: ２）最好不要用DSS。蛋白交联情况和处理时间有关，结果无法用其他实验验证。如果
: 是这一步的问题，你都无从查找。
: ３）低PH洗脱液可以从Agarose上洗脱抗体，但是否能保证打开蛋白－抗体的结合未知
: ，与多种因素相关。
: ４）你IP时的缓冲体系是什么，不会是１XCS的裂解液吧。
: ５）你蛋白上样太少了。直接加小体积上样Buffer煮，全上了做WB。
: ６）膜蛋白IP不好做。
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