I***a
发帖数: 13467 | 1 如图，一般都是在exons 里面吗？后面有一大段non-synonymous coding 可以考虑吗？
多谢 |
I***a
发帖数: 13467 | 2 我这个问题是不是过于弱智了？
【在 I***a 的大作中提到】
: 如图，一般都是在exons 里面吗？后面有一大段non-synonymous coding 可以考虑吗？
: 多谢
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f*****f
发帖数: 195 | 3 你设计primer的目的是什么？假如要半定量mRNA的话，引物最好跨过两个不同的exon，
这样不至于以基因组为模板pcr。
【在 I***a 的大作中提到】
: 如图，一般都是在exons 里面吗？后面有一大段non-synonymous coding 可以考虑吗？
: 多谢
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I***a
发帖数: 13467 | 4 多谢，
比较两组老鼠一些基因的表达差异，
我本想把引物放在离mRNA尾巴的200bp左右，但是不知道有些区域是不是转录后被剪切
掉了
以前做细菌的，对高等生物的这些实验细节不太清楚。 |
f*****f
发帖数: 195 | 5 比较基因的表达差异你是指mRNA水平？与原核不同，转录mrna会有剪切。
因为你提取RNA做qPCR时，有时不可避免的混入微量的基因组DNA，为避免检测干扰，一
条引物分别与不同的exon匹配，减少干扰。有专门的qPCR软件，比如免费的perlprimer
就可以，粘贴mRNA和基因组序列就可以了，引物对会有打分。
【在 I***a 的大作中提到】
: 多谢，
: 比较两组老鼠一些基因的表达差异，
: 我本想把引物放在离mRNA尾巴的200bp左右，但是不知道有些区域是不是转录后被剪切
: 掉了
: 以前做细菌的，对高等生物的这些实验细节不太清楚。
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I***a
发帖数: 13467 | 6 一般怎么考虑剪切这个问题呢？
特别是一些exons 的选择 |
f*****f
发帖数: 195 | 7 首先ncbi上找到该基因 基因组序列和mRNA序列，
两个引物之间的intron越长越好。引物在exon和intron的边界最好，mRNA amplicon长
度我习惯设定100bp左右。
你可以下载一个perlprimer，有real-time pcr的选项，操作界面比较简单，你选择一
个引物看看在genomic/mRNA的哪个位置就应该大致明白了。
【在 I***a 的大作中提到】
: 一般怎么考虑剪切这个问题呢？
: 特别是一些exons 的选择
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s******r
发帖数: 1245 | 8 去harvard的primerbank里找你的基因，老鼠的很多都有，一个基因会有不止一对，有
的还有validation data，自己试一下挑最好用的
【在 I***a 的大作中提到】
: 如图，一般都是在exons 里面吗？后面有一大段non-synonymous coding 可以考虑吗？
: 多谢
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