S******e
发帖数: 393 | 1 买了几个基因的siRNA pool(含3个siRNA)，同样的浓度与方法去转，有的work, 有的不
work, 用的是invitrogen 的 lipofectamine RNAiMAX
不甘心，又根据发表的paper(nature子刊)上的序列，将KD没效果的基因的siRNA序列重
新从dharmacon合成Duplex, 但转染后在我手里还是不work, 但发表的paper里用的也是
siRNA,且KD效果很好阿，所以序列应该是work的。是不是我方法有问题？
有什么好地siRNA 转染方法？ lentivirus介导的shRNA转染会不会KD成功率更高些？
多谢！
shRNA construct(不用virus，就是一般的质粒)的KD效果会不会比siRNA效果好？ 有人
比较过么？ |
C****b
发帖数: 90 | 2
转染siRNA的终浓度也挺重要， 一般是5～50nM。浓度太高， 可能有毒性和side-
effect, 所以要平衡；再者，转染后的时间也重要，不同的基因KD的时间不同，有的48
小时就可以了， 但有的需要72小时。
【在 S******e 的大作中提到】
: 买了几个基因的siRNA pool(含3个siRNA)，同样的浓度与方法去转，有的work, 有的不
: work, 用的是invitrogen 的 lipofectamine RNAiMAX
: 不甘心，又根据发表的paper(nature子刊)上的序列，将KD没效果的基因的siRNA序列重
: 新从dharmacon合成Duplex, 但转染后在我手里还是不work, 但发表的paper里用的也是
: siRNA,且KD效果很好阿，所以序列应该是work的。是不是我方法有问题？
: 有什么好地siRNA 转染方法？ lentivirus介导的shRNA转染会不会KD成功率更高些？
: 多谢！
: shRNA construct(不用virus，就是一般的质粒)的KD效果会不会比siRNA效果好？ 有人
: 比较过么？
|
S******e
发帖数: 393 | 3 我转染是用的终浓度是60nM和120nM两个浓度，
48小时后收样裂解跑胶 |
g*********5
发帖数: 2533 | 4 发表的paper里用的也是
you should not 100% believe the published data :) |
C****b
发帖数: 90 | 5
感觉有些高。收集时， 你有没有看细胞是否健康？
【在 S******e 的大作中提到】
: 我转染是用的终浓度是60nM和120nM两个浓度，
: 48小时后收样裂解跑胶
|
S******e
发帖数: 393 | 6 准备再做一次试试看，再不行就考虑用lentivirus
48
【在 C****b 的大作中提到】
:
: 感觉有些高。收集时， 你有没有看细胞是否健康？
|
S******e
发帖数: 393 | 7 与没转的比稍差，但总体上比较健康
【在 C****b 的大作中提到】
:
: 感觉有些高。收集时， 你有没有看细胞是否健康？
|
v***a
发帖数: 1242 | 8 你work不work是用什么方法去access的？western还是rna？如果是western也要看抗体的
【在 S******e 的大作中提到】
: 买了几个基因的siRNA pool(含3个siRNA)，同样的浓度与方法去转，有的work, 有的不
: work, 用的是invitrogen 的 lipofectamine RNAiMAX
: 不甘心，又根据发表的paper(nature子刊)上的序列，将KD没效果的基因的siRNA序列重
: 新从dharmacon合成Duplex, 但转染后在我手里还是不work, 但发表的paper里用的也是
: siRNA,且KD效果很好阿，所以序列应该是work的。是不是我方法有问题？
: 有什么好地siRNA 转染方法？ lentivirus介导的shRNA转染会不会KD成功率更高些？
: 多谢！
: shRNA construct(不用virus，就是一般的质粒)的KD效果会不会比siRNA效果好？ 有人
: 比较过么？
|
S******e
发帖数: 393 | 9 Western, 抗体没问题，有对照，我之前也用这抗体做了很多其他的实验
体的
【在 v***a 的大作中提到】
: 你work不work是用什么方法去access的？western还是rna？如果是western也要看抗体的
|
g*********5
发帖数: 2533 | 10 10nM is enough for my gene with lipofectamineRNAimax |
l**********1
发帖数: 5204 | 11 pls try shRNA
for reducing off target effects.
LZ 考古下上周的帖子
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31683985.html
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31696153.html
BTW 借楼下的光
siRNA MIT online design tool:
link:
//sirna.wi.mit.edu/
【在 S******e 的大作中提到】
: Western, 抗体没问题，有对照，我之前也用这抗体做了很多其他的实验
:
: 体的
|
w********r
发帖数: 1431 | 12 按照你说的，有的work，有的不work，
如果是同样的细胞同样的转染条件的话，那么不work的估计就是不work了。
就算nature子刊的说这个序列有效，也未必是真的有效。。。
whitehead institute的online siRNA design就不错，我们一般设计完了挑三个，基本
两个work
【在 S******e 的大作中提到】
: 买了几个基因的siRNA pool(含3个siRNA)，同样的浓度与方法去转，有的work, 有的不
: work, 用的是invitrogen 的 lipofectamine RNAiMAX
: 不甘心，又根据发表的paper(nature子刊)上的序列，将KD没效果的基因的siRNA序列重
: 新从dharmacon合成Duplex, 但转染后在我手里还是不work, 但发表的paper里用的也是
: siRNA,且KD效果很好阿，所以序列应该是work的。是不是我方法有问题？
: 有什么好地siRNA 转染方法？ lentivirus介导的shRNA转染会不会KD成功率更高些？
: 多谢！
: shRNA construct(不用virus，就是一般的质粒)的KD效果会不会比siRNA效果好？ 有人
: 比较过么？
|
S******e
发帖数: 393 | 13 THX，学习了
【在 l**********1 的大作中提到】
: pls try shRNA
: for reducing off target effects.
: LZ 考古下上周的帖子
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31683985.html
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31696153.html
: BTW 借楼下的光
: siRNA MIT online design tool:
: link:
: //sirna.wi.mit.edu/
|
S******e
发帖数: 393 | 14 正在做第二次transfection, 再没有效果估计得考虑重新设计了
【在 w********r 的大作中提到】
: 按照你说的，有的work，有的不work，
: 如果是同样的细胞同样的转染条件的话，那么不work的估计就是不work了。
: 就算nature子刊的说这个序列有效，也未必是真的有效。。。
: whitehead institute的online siRNA design就不错，我们一般设计完了挑三个，基本
: 两个work
|
