s******y
发帖数: 28562 | 1 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
这个质粒的用法也描述得非常含糊。
我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！ |
a****n
发帖数: 43 | 2 这样不行。XhoI和BamH1之间还有部分miR30的序列。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
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s******y
发帖数: 28562 | 3 那到底应该用哪两个酶啊？今天我打电话问了公司里的人，他们说应该先用
XhoI 和 MluI把一大块cassette 切下来接到别的vector 去，然后再用其他酶来
接我要用的22Nt,然后再移回去。可是接电话的那个人一下子也不知道到底该用哪个酶
。你要是知道的话麻烦告诉我吧。谢谢了！
【在 a****n 的大作中提到】
: 这样不行。XhoI和BamH1之间还有部分miR30的序列。
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l*******g
发帖数: 63 | 4 http://www.bmgc.umn.edu/prod/groups/ahc/@pub/@ahc/@bmgc/documen
Page 6
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
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o**4
发帖数: 35028 | 5 这么麻烦啊，为啥不用pLKO.1，
克隆超级简单
【在 s******y 的大作中提到】
: 那到底应该用哪两个酶啊？今天我打电话问了公司里的人，他们说应该先用
: XhoI 和 MluI把一大块cassette 切下来接到别的vector 去，然后再用其他酶来
: 接我要用的22Nt,然后再移回去。可是接电话的那个人一下子也不知道到底该用哪个酶
: 。你要是知道的话麻烦告诉我吧。谢谢了！
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a****n
发帖数: 43 | 6 他们其实是用XhoI 和 EcoRI 插入shRNA序列的。详细序列见：
http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n9/pdf/nmeth923.pdf
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
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s******y
发帖数: 28562 | 7 谢谢！我的疑惑也就是因此而来的。因为E.coRI 不能直接用（在pGIPZ上有另外一个切
点）。但是在XhoI 和 EcoRI 之间其实还有一个BamHI, 这个倒是唯一切点的。
我就很奇怪他们为什么不直接用XhoI 和 BamHI 来做插入。
另外。我的一个问题是，在插入那个shRNA 序列的时候，是只插那识别的22Nt anti-
sense sequence呢，还是连旁边的stem 也一并插入（总共放进６０Nt大小
的序列？）
【在 a****n 的大作中提到】
: 他们其实是用XhoI 和 EcoRI 插入shRNA序列的。详细序列见：
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n9/pdf/nmeth923.pdf
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s******y
发帖数: 28562 | 8 由于一些特殊原因，我们需要荧光蛋白来作为marker. 不能用抗药性来选。因为我们做
的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
，如果你知道的话麻烦推荐一下。
【在 o**4 的大作中提到】
: 这么麻烦啊，为啥不用pLKO.1，
: 克隆超级简单
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X******n
发帖数: 914 | 9 那你应该用诱导型的载体吧？
你看看Scott Lowe他们的文章吧。他们做了一些载体，应该有你想要的。
我都是直接合成97个碱基，包括目的基因的序列和mir30. |
s******y
发帖数: 28562 | 10 诱导性的一般都是tet, 这个对我们的细胞有很强的影响。综合了各种考虑之后，
我们暂时决定还是用一般的载体，而不是诱导型的。当然以后不排除会用诱导型的
来做一些confirmation test.
【在 X******n 的大作中提到】
: 那你应该用诱导型的载体吧？
: 你看看Scott Lowe他们的文章吧。他们做了一些载体，应该有你想要的。
: 我都是直接合成97个碱基，包括目的基因的序列和mir30.
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H*******i
发帖数: 196 | |
s******y
发帖数: 28562 | 12 啊？从来没有听过这种用法。貌似不行吧，LacI promoter 是细菌promoter.
【在 H*******i 的大作中提到】
: 用LacI/IPTG在真核细胞里有啥问题么？
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H*******i
发帖数: 196 | 13 随便问问 原核里面的Activator在真核里面不管用是肯定的
不过因为原核里面最常用的LacI/TetR都是repressor，而且都有造成DNA looping的可
能，所以问问。另外Yeast里面Gal1是可以IPTG诱导的吧。
真核里面ptet也是基于TetR吧 |
a****n
发帖数: 43 | 14 他们最初用的载体是pSM2,在那里用XhoI和EcoRI是可以的。pGIPZ上的BamH1应该是构建
载体的时候引入的，并没有用作多克隆位点。
需要连旁边的stem一起插入。在Xho1和EcoR1之间应该是stem-sense-loop-antisense-
stem.
pGIPZ用Xho1，Mlu1切；插入序列按Hannon文章中的方法PCR后用Xho1，EcoR1切（后直
接合成）；切下pGIPZ上的EcoR1，Mlu1片段（235bp）； 做三片段连接就可以了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢！我的疑惑也就是因此而来的。因为E.coRI 不能直接用（在pGIPZ上有另外一个切
: 点）。但是在XhoI 和 EcoRI 之间其实还有一个BamHI, 这个倒是唯一切点的。
: 我就很奇怪他们为什么不直接用XhoI 和 BamHI 来做插入。
: 另外。我的一个问题是，在插入那个shRNA 序列的时候，是只插那识别的22Nt anti-
: sense sequence呢，还是连旁边的stem 也一并插入（总共放进６０Nt大小
: 的序列？）
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s******y
发帖数: 28562 | 15 谢谢！
【在 a****n 的大作中提到】
: 他们最初用的载体是pSM2,在那里用XhoI和EcoRI是可以的。pGIPZ上的BamH1应该是构建
: 载体的时候引入的，并没有用作多克隆位点。
: 需要连旁边的stem一起插入。在Xho1和EcoR1之间应该是stem-sense-loop-antisense-
: stem.
: pGIPZ用Xho1，Mlu1切；插入序列按Hannon文章中的方法PCR后用Xho1，EcoR1切（后直
: 接合成）；切下pGIPZ上的EcoR1，Mlu1片段（235bp）； 做三片段连接就可以了。
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q***7
发帖数: 144 | |
x****u
发帖数: 530 | 17 我用的pRRL-U6-hPGK-GFP
效果还不错，可是我的细胞shRNA组成型表达后就死了。
如果你的细胞不会死的话，我倒是推荐这个载体。
到。
【在 s******y 的大作中提到】
: 由于一些特殊原因，我们需要荧光蛋白来作为marker. 不能用抗药性来选。因为我们做
: 的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
: 其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
: ，如果你知道的话麻烦推荐一下。
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s******y
发帖数: 28562 | 18 谢谢！我们的细胞，在我们所需要用的shRNA 成功表达之后也会死。
正是因为这个原因我们需要用荧光蛋白标记而不能用药选。
你用的那个质粒做克隆的时候方便么？那个什么pGIPZ克隆起来老麻烦了。
【在 x****u 的大作中提到】
: 我用的pRRL-U6-hPGK-GFP
: 效果还不错，可是我的细胞shRNA组成型表达后就死了。
: 如果你的细胞不会死的话，我倒是推荐这个载体。
:
: 到。
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b**********8
发帖数: 349 | 19 可以用pLenti lox3.7这个载体，自带EGFP，用HpaI—XhoI这两个酶切位点 |
f******g
发帖数: 1003 | 20 把那个EcorI突变了，就可以了。一两天的工作。 |
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c*******7
发帖数: 314 | 21 tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问 |
s******y
发帖数: 28562 | 22 谢谢！能不能说说为什么要design 3‘mismatch？ 这个是什么意思啊？
【在 c*******7 的大作中提到】
: tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
: mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问
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s******y
发帖数: 28562 | 23 这就是我感到非常疑惑的一点。因为我打电话问过pGIPZ 的相关公司，他们告诉我
说他们克隆的时候都是非常间接的，还指给了我两三篇文章，包括一篇在Nature
Method上的，上面用的方法都是非常间接的用XhoI 和 MluI 把一个非常大的cassette
在不同质粒之间移来移去的做法 （顺便吐槽一下，当时我看了其中一篇文章之后就
想，怎么这个纯粹讲克隆方法的文章也能发Nature Method？他们对文章要求到底是什
么标准啊？）
所以我就非常疑惑的是，他们为什么不象你说的那样做？因为要改一下那个EcoRI是很
容易的事情啊。莫非是改了之后有什么奇怪后果？
【在 f******g 的大作中提到】
: 把那个EcorI突变了，就可以了。一两天的工作。
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H*******i
发帖数: 196 | 24 10K多的质粒有时候修改操作起来麻烦点？有的实验室用惯了可能也就习惯了，因为他
们的操作都在另外两个工作质粒上，每次只需要把基因修改在工作质粒上，然后连成这
个载体就行了。。
看图谱EcoRI在HygroR那个位置，只要换个同义突变就行了 |
H*******i
发帖数: 196 | 25 另外随手下了个这个质粒GB文件，如果没错的话
aacagaaggCTCGAGgtaaccGGATCCtgatcaGAATTCaagggg
依次是XhoI BhamHI EcoRI 用BhamHI看着没啥问题啊？
如果要用XhoI 和EcoRI
首先你需要找一个载体 就当是PUC+Kan/clora这种
没有XhoI EcoRI MluI
然后把pGIPZXhoI到MluI clone到你的工作载体上，再用XhoI EcoRI插入目标序列，最
后用XhoI MluI切回你的pGIPZ 以后所有的clone都在工作载体上，所以一直用下去每次
也就多花3天/4天时间。 |
f******g
发帖数: 1003 | 26 因为open biosystem最开始使用的是pSM2质粒，设计好的shRNA全部克隆到这个载体里
面，后来有了慢病毒lentiviral vector（pGIpz），他们就把原来的psm2的shRNA全部
克隆到新的pgipz上面，另外还有新设计的shRNA。
突变掉另外那个EcorI没有任何影响，我们已经做了。
还有，如果你想转干细胞，至少是造血干，pGIPz不是一个很好的选择，因为他的启动
子是CMV，转干细胞效率极低。如果是普通的细胞系，应该没有问题。原代细胞，我没
有试过。
如果你实在没有好的选择，短信我，我有修饰过的pGIPz载体，很好用。但是要和老板
签署MTA。
cassette
【在 s******y 的大作中提到】
: 这就是我感到非常疑惑的一点。因为我打电话问过pGIPZ 的相关公司，他们告诉我
: 说他们克隆的时候都是非常间接的，还指给了我两三篇文章，包括一篇在Nature
: Method上的，上面用的方法都是非常间接的用XhoI 和 MluI 把一个非常大的cassette
: 在不同质粒之间移来移去的做法 （顺便吐槽一下，当时我看了其中一篇文章之后就
: 想，怎么这个纯粹讲克隆方法的文章也能发Nature Method？他们对文章要求到底是什
: 么标准啊？）
: 所以我就非常疑惑的是，他们为什么不象你说的那样做？因为要改一下那个EcoRI是很
: 容易的事情啊。莫非是改了之后有什么奇怪后果？
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a****d
发帖数: 1919 | 27 FUGW-H1 lentiviral vector for shRNA. It has ubiquitin promoter for EGFP and
H1 promoter for shRNA expression.
You can find it on Addgene.
到。
【在 s******y 的大作中提到】
: 由于一些特殊原因，我们需要荧光蛋白来作为marker. 不能用抗药性来选。因为我们做
: 的基因被KD之后细胞过上几天就死了。如果用抗药性来选的话会最终什么细胞都得不到。
: 其实也不一定就必须用pGIPZ, 如果有其他高效的KD vector 有荧光蛋白标记的话也行
: ，如果你知道的话麻烦推荐一下。
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s******y
发帖数: 28562 | 28 谢谢大家给了那么多的好建议！我一开始就想动手去改那个pGIPZ 里面的MCS site
的。其实即使不用改，在那个XhoI - EcoRI 旁边就有一个BamHI。所以我非常疑惑那个
公司为什么放着这么简单的方法不用而非要那么麻烦的在不同的质粒之间倒腾。但是听
起来貌似是他们的shRNA 很就以前就做在pSM2里面了所以就将错就错的啊。
不过上面一个好心的网友和另外一个发私信给我的网友都告诉了我要小心这个CMV
promoter, 这么一听我就有点介意了。因为虽然我主要用的是immortalized 细胞系,但
是偶尔也会整整一些primary cells, blood cells 之类的。如果CMV 有这个问题的话
我就不想在上面投入太多精力了。
我在addgene 上找另外两个网友说的荧光标记的shRNA vector 的时候，非常碰巧的看
到了这个 pLKO.3G, 上面的说明是 pLKO.1-puro 改成的。不知道有没有人用过？ http://www.addgene.org/14748/
如果这个好用的话我可能就用这个了。因为我的好几个其他shRNA construct 都是构建
在pLKO.1-puro上的。
另外，关于对照组，我以前都是用 GFP-shRNA 来做对照，但是这次要同时在细胞里表
达一个GFP fusion protein, 就不方便用这个了。我听说也有人用luciferase来做non-
KO control, 不知道能否麻烦知道的人贴一下序列或者referene? |
s******y
发帖数: 28562 | 29 关于 Tet-inducible shRNA，除了Open Biosystem 的，addgene 上有没有便宜的？
对了，能不能麻烦你多说两句那个design 3‘ mismatch 是什么意思？
【在 c*******7 的大作中提到】
: tet on的可以用obs的pTRIPZ，有荧光，XhoI、EcoRI clone很好用，最好design 3‘
: mismatch。pGIPTZ没用过，可以打电话问
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S*********s
发帖数: 304 | 30 addgene plko-tet-ON
【在 s******y 的大作中提到】
: 我们正打算把一段shRNA 的识别序列放进pGIPZ vector 里面，可以我们从来没有用过
: 它，所以不知道到底应该放在哪两个restriction site 之间。Open Biosystem 里面对
: 这个质粒的用法也描述得非常含糊。
: 我的猜测是XhoI and BamHI, 不知道能否有用过这个质粒的人来验证一下？谢谢！
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s******y
发帖数: 28562 | 31 非常感谢！找到了! 他们改名叫做Tet-pLKO-puro， 因为：
“The name was changed to clarify that this plasmid does not contain and is
not related to the trademarked Tet-On(R) system sold by Clontech. ”
【在 S*********s 的大作中提到】
: addgene plko-tet-ON
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s******y
发帖数: 28562 | 32 所以我也很吃惊啊，因为上面有同学说BamHI 可能是构建质粒的时候带进去的，
可能不是给我们用来克隆的。但是明明这个BamHI是夹在XhoI 和EcoRI之间的啊，
如果用XhoI 和EcoRI的话就会把BamHI切掉的啊。所以干吗要这么麻麻烦烦的移来移去
啊，直接用XhoI和BamHI不是更简单么？
不过也有同学指出说那个公司以前的shRNA可能都是用XhoI 和EcoRI构建在pSM2里面的
，所以有可能他们为了省事就将错就错的直接用XhoI和MluI 把一大块东西都剪过去算
了 (不过居然这样也能发个Nature Method...)
【在 H*******i 的大作中提到】
: 另外随手下了个这个质粒GB文件，如果没错的话
: aacagaaggCTCGAGgtaaccGGATCCtgatcaGAATTCaagggg
: 依次是XhoI BhamHI EcoRI 用BhamHI看着没啥问题啊？
: 如果要用XhoI 和EcoRI
: 首先你需要找一个载体 就当是PUC+Kan/clora这种
: 没有XhoI EcoRI MluI
: 然后把pGIPZXhoI到MluI clone到你的工作载体上，再用XhoI EcoRI插入目标序列，最
: 后用XhoI MluI切回你的pGIPZ 以后所有的clone都在工作载体上，所以一直用下去每次
: 也就多花3天/4天时间。
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f******g
发帖数: 1003 | 33 用Bamhi会损坏mir30，影响shRNA的表达
另外，plko载体好像没有荧光，至少我们最开始用的那个open biosys没有
【在 s******y 的大作中提到】
: 所以我也很吃惊啊，因为上面有同学说BamHI 可能是构建质粒的时候带进去的，
: 可能不是给我们用来克隆的。但是明明这个BamHI是夹在XhoI 和EcoRI之间的啊，
: 如果用XhoI 和EcoRI的话就会把BamHI切掉的啊。所以干吗要这么麻麻烦烦的移来移去
: 啊，直接用XhoI和BamHI不是更简单么？
: 不过也有同学指出说那个公司以前的shRNA可能都是用XhoI 和EcoRI构建在pSM2里面的
: ，所以有可能他们为了省事就将错就错的直接用XhoI和MluI 把一大块东西都剪过去算
: 了 (不过居然这样也能发个Nature Method...)
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