i*****i
发帖数: 154 | 1 最近在做基于CRISPR的knockout，感觉很强大啊。
而且效率也非常高，不知道以后会不会完全取代siRNA和shRNA啊？
大牛们讲讲。 |
j******i
发帖数: 939 | 2 各有所长吧。zfn, talen, 出来也没有取代shRNA啊。CRISPR目前至少要解决两个问题
，一个是太大，难deliver, 一个是off-targeting. |
w*****r
发帖数: 2061 | 3 CRISPR比TALEN简单多了
都是RNA guide，off-targeting跟shRNA差不多吧，不知道Cas9 nuclease没有guide的
话，活性怎么样
【在 j******i 的大作中提到】
: 各有所长吧。zfn, talen, 出来也没有取代shRNA啊。CRISPR目前至少要解决两个问题
: ，一个是太大，难deliver, 一个是off-targeting.
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z*******a
发帖数: 175 | 4 RNAi在organism level 有用吗？ |
s******s
发帖数: 13035 | 5 听上去比talen啥强的多，尤其效率巨高。
据说还可以突变失活，放一排tiling RNA上去标记基因。
【在 w*****r 的大作中提到】
: CRISPR比TALEN简单多了
: 都是RNA guide，off-targeting跟shRNA差不多吧，不知道Cas9 nuclease没有guide的
: 话，活性怎么样
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s******s
发帖数: 13035 | 6 不过取代不容易。siRNA有点像hemizygous,
CRISPR现阶段只能homozygous。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 最近在做基于CRISPR的knockout，感觉很强大啊。
: 而且效率也非常高，不知道以后会不会完全取代siRNA和shRNA啊？
: 大牛们讲讲。
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x********e
发帖数: 35261 | 7 这个的好处主要是genome editing吧 RNAi都差不了多少
【在 i*****i 的大作中提到】
: 最近在做基于CRISPR的knockout，感觉很强大啊。
: 而且效率也非常高，不知道以后会不会完全取代siRNA和shRNA啊？
: 大牛们讲讲。
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j****n
发帖数: 3370 | 8 Knock out 和 knock down的区别吧
不知道crispr用于knock down容易实现不？貌似用于gene activation已经实现了
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6
【在 i*****i 的大作中提到】
: 最近在做基于CRISPR的knockout，感觉很强大啊。
: 而且效率也非常高，不知道以后会不会完全取代siRNA和shRNA啊？
: 大牛们讲讲。
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r******g
发帖数: 600 | 9 Crispr can definitely knockdown as well.
https://www.cell.com/abstract/S0092-8674(13)00826-X?switch=standard
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3664290/
The designing is not too complicated.
【在 j****n 的大作中提到】
: Knock out 和 knock down的区别吧
: 不知道crispr用于knock down容易实现不？貌似用于gene activation已经实现了
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6
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s******s
发帖数: 13035 | 10 没看这两片。不过理论上可以用polymorphysm只target一个allele，或者两个都
KO，然后加一个低表达的载体进去？
【在 r******g 的大作中提到】
: Crispr can definitely knockdown as well.
: https://www.cell.com/abstract/S0092-8674(13)00826-X?switch=standard
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3664290/
: The designing is not too complicated.
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a******a
发帖数: 283 | 11 Genome editing The Berkeley and San Francisco campuses of the University of
California have announced a US$12-million project focused on the CRISPR/Cas9
gene-editing technology, the powerful technique that allows targeted
rewriting of genomes (see Nature http://doi.org/rz6; 2014). The Innovative Genomics Initiative will receive $10 million from the Li Ka Shing Foundation in Hong Kong, with the rest made up by the two universities. Jennifer Doudna, the Berkeley-based executive director of the initiative, says that it will focus on developing the technology for human-health applications and creating a library of research resources so that others can use the technique.
【在 s******s 的大作中提到】
: 没看这两片。不过理论上可以用polymorphysm只target一个allele，或者两个都
: KO，然后加一个低表达的载体进去？
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d****i
发帖数: 2346 | 12 很想用CRISPR，但是担心设计，合成，连接克隆，转染进去以后发现没作用，有off
target，折腾了好长时间拿不到phenotype。
问一下楼主，你做KO有没有筛单克隆？那个过程我感觉蛮复杂的。 |
j******i
发帖数: 939 | 13 克隆狠容易拿到。gRNA成功率很高，但是不同的loci效率有不同，一般设计三个gRNA，
挑其中效率最高的用。off-target是没办法的，或者用double nickase吧, 不过效率会
降低。筛选克隆的过程是麻烦了点，费时费力，一般用gfp, puro,来enrich, 不过都不
是最好的方法，各显神通吧。
【在 d****i 的大作中提到】
: 很想用CRISPR，但是担心设计，合成，连接克隆，转染进去以后发现没作用，有off
: target，折腾了好长时间拿不到phenotype。
: 问一下楼主，你做KO有没有筛单克隆？那个过程我感觉蛮复杂的。
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j******i
发帖数: 939 | 14 ZFN, TALEN, CRISPR我都在用。挑最喜欢的，还是ZFN，因为他小，很容易放到viral
vector里边。但是它贵啊，自己合成的话，成功率又不高。TALEN克隆费力了一点，不
过熟练的话，一周就能拿到了。CRISPR定oligo, 克隆，怎么也要一周了吧。TALEN的专
一性很好，CRISPR的潜在off-targets一搜能搜出一大堆，吓死人。
shRNA是RNA识别RNA, CRISPR是RNA识别DNA+cas9识别DNA, 所以你不能简单的说都是RNA
guide. Cas9没有gRNA就没有办法cut on target了。当然，不知道cas9本身有没有细
胞毒性。
【在 w*****r 的大作中提到】
: CRISPR比TALEN简单多了
: 都是RNA guide，off-targeting跟shRNA差不多吧，不知道Cas9 nuclease没有guide的
: 话，活性怎么样
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d****i
发帖数: 2346 | 15 请教楼上高人，
1)利用几个大实验室的在线设计工具，设计三个gRNA，构成三个载体，转染细胞。假定
转染效率不是瓶颈，这个一般是不是直接做realtime或者western挑一个效果最好的就
用了？还要不要做off target检测？我担心的是三个里面还没一个效果满意的。
2)如果我跳过筛单克隆这一步，转染后加药稍微筛一下，然后直接进入下游实验。这个
情况下效率会比siRNA更好吗？
谢谢！ |
y***y
发帖数: 709 | 16 也准备上CRISPR的人搭车问一下
怎么从设计的三个sgRNA里面筛选到效率高呢？
把gblock合成好之后，分别和cas9质粒共转染然后做RFLP吗？
还是收蛋白看目的基因的表达情况？
我要做的是成纤维细胞，转染效率很低，不知道在低转染效率的情况下如何筛选到效率
高的sgRNA，希望得到有经验人的指点。
【在 j******i 的大作中提到】
: 克隆狠容易拿到。gRNA成功率很高，但是不同的loci效率有不同，一般设计三个gRNA，
: 挑其中效率最高的用。off-target是没办法的，或者用double nickase吧, 不过效率会
: 降低。筛选克隆的过程是麻烦了点，费时费力，一般用gfp, puro,来enrich, 不过都不
: 是最好的方法，各显神通吧。
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a*****n
发帖数: 2835 | 17 有lenti virus系统了
【在 y***y 的大作中提到】
: 也准备上CRISPR的人搭车问一下
: 怎么从设计的三个sgRNA里面筛选到效率高呢？
: 把gblock合成好之后，分别和cas9质粒共转染然后做RFLP吗？
: 还是收蛋白看目的基因的表达情况？
: 我要做的是成纤维细胞，转染效率很低，不知道在低转染效率的情况下如何筛选到效率
: 高的sgRNA，希望得到有经验人的指点。
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y***y
发帖数: 709 | 18 也有看到这个系统了
可是我担心cas9留在基因组中可能会对细胞有影响吧
【在 a*****n 的大作中提到】
: 有lenti virus系统了
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s******r
发帖数: 1245 | 19 先找个转染效率高的细胞系测一下挑个最好的，人的细胞可以用293，转完收DNA做RFLP
或者surveryor或者测序
fibroblast转染也没那么差啦，有条件做二代测序的可以直接在fibroblast里做，很
sensitive，不差钱的话去找公司做测序也就百十来块一个sample，省很多事
【在 y***y 的大作中提到】
: 也准备上CRISPR的人搭车问一下
: 怎么从设计的三个sgRNA里面筛选到效率高呢？
: 把gblock合成好之后，分别和cas9质粒共转染然后做RFLP吗？
: 还是收蛋白看目的基因的表达情况？
: 我要做的是成纤维细胞，转染效率很低，不知道在低转染效率的情况下如何筛选到效率
: 高的sgRNA，希望得到有经验人的指点。
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b***2
发帖数: 348 | 20 把crispr的蛋白想办法直接弄进细胞有没有可行性和优势？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 21
你是不是说用TAT一类肽引导进去？发一篇文章没问题。但是我个人觉得没多大优势，
因为现在已经把cas9和gRNA做到一个载体里面了，即使你把蛋白直接弄进细胞，还是要
转染gRNA的plasmid。
【在 b***2 的大作中提到】
: 把crispr的蛋白想办法直接弄进细胞有没有可行性和优势？
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b***2
发帖数: 348 | 22 gRNA本身不大，现在的技术手段可以把两个东西一起弄进去。
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 你是不是说用TAT一类肽引导进去？发一篇文章没问题。但是我个人觉得没多大优势，
: 因为现在已经把cas9和gRNA做到一个载体里面了，即使你把蛋白直接弄进细胞，还是要
: 转染gRNA的plasmid。
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d****i
发帖数: 2346 | 23 http://www.nature.com/nmeth/journal/v11/n4/full/nmeth.2857.html
Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target
effects |
l***y
发帖数: 638 | 24 cas9挺大的蛋白
效率是关键
这么折腾有啥优势？
【在 b***2 的大作中提到】
: gRNA本身不大，现在的技术手段可以把两个东西一起弄进去。
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i*****i
发帖数: 154 | 25 可不可以先做一个Cas9稳定表达的细胞，然后把gRNA像siRNA那样transfection进去？
理论上差不多，gRNA是单链，siRNA是双链。 |
j******i
发帖数: 939 | 26 1. off-target 和细胞毒性 跟cas9 浓度有关。
2. 涉及dna的vector有插入到基因组的风险。是一种insertional mutagenesis.
3. 从dna表达的cas9存在时间长，筛选得到的克隆其实并非纯克隆，而是很多克隆的混
合，因为CRISPR会一直在cut.
4. Overexpression cas9 可能引起免疫反应。
5. Transfection或nucleofection在很多原代细胞效率很低，而且有毒性。
6. 蛋白不用表达，受精卵注射的时候用mRNA, 可能跟dna难表达有关。
7. 能想到的暂时只有这些了。
【在 l***y 的大作中提到】
: cas9挺大的蛋白
: 效率是关键
: 这么折腾有啥优势？
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