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全部话题 - 话题: ligation
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l**********1
发帖数: 5204
1
那就分几段选GC含量不太高的段做roche DIG PCR labeling 如何? or try another
way:
: ligation-anchored PCR
一句话就是用内切酶对应的人工引物锚定:high GC contents and complex secondary
structure of long mRNA 的5'和3'端 做人工锚定引物PCR 包括 DIG PCR labeling
Reference from published year earlier:
: 1)
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/
: 2)
: http://aem.asm.org/content/75/6/1552.abstract
: 3)
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14660366
G*****h
发帖数: 320
2
来自主题: Biology版 - 求教基因组PCR
2-kb with 44% GC should not be too difficult. Below are what I can think of
at the moment:
1) There may be a very difficult secondary structure in the sequence (such
as an inverted repeat). If there is
indeed an inverted repeat, you have to run two separate PCR and then ligate
your two product together.
2) Some other secondary structure problems can be resolved by designing
longer primers, so you can have a
higher annealing temperature to overcome the problem.
3) Your template DNA is degraded, s... 阅读全帖
G*****h
发帖数: 320
3
来自主题: Biology版 - 求教基因组PCR
Oh, just realized from your last post that you used cDNA... In this case,
please make sure that your cDNA was
made from cells/tissues that actually express that particular gene of your
interest.
Run a positive control and see if you could amplify a smaller fragment as
suggested by someone else is a
good idea.

of
ligate
to
v***a
发帖数: 1242
4
来自主题: Biology版 - 如果往ligation buffer里加ATP
加到终浓度多少比较合适?
买来的ATP是10mM的。
谢谢~
另,看到NEB上说ATP要ribo的,怎么知道是不是呢?product sheet上也没有说。
s******y
发帖数: 28562
5
来自主题: Biology版 - 如果往ligation buffer里加ATP
为什么要额外加啊?
Buffer 里都有ATP的
s******y
发帖数: 28562
6
来自主题: Biology版 - 如果往ligation buffer里加ATP
如果是这个原因的话,那么就直接加一般的ATP 好了。
ribo不 ribo什么的,其实是指ribonucleotide 与deoxy-ribonucleotide
来作区别,是怕一些小本什么的犯傻把dATP加进去了。
o*****r
发帖数: 156
7
来自主题: Biology版 - 如果往ligation buffer里加ATP
Yes, you are right.
v***a
发帖数: 1242
8
来自主题: Biology版 - 如果往ligation buffer里加ATP
呵呵 原来如此啊
谢谢楼上两位
j****x
发帖数: 1704
9
来自主题: Biology版 - 请问各位cloning高手
如果质粒不特别大的话,感觉比较简单的策略就是NEB的突变策略。
在想删除的位点两侧设计“背靠背”引物(必须5'端磷酸化修饰),把你需要替换的序
列设计在引物上。扩增整个质粒,PCR产物就是线性化的目的质粒序列,然后self-
ligation即可。

,
s**e
发帖数: 1523
10
来自主题: Biology版 - 如何对付磨洋工的老印学生工
Tech有时候也磨洋工啊。我们实验室的小黑,做ligation的时候,切了载体,可是没切
PCR产物,然后做不出来说感受态细胞不好。要不是我一步步问下来就被他忽悠了。我
也很郁闷。而且我不像楼上的ibmgoog,还能tough得起来,我觉得我自己就挺面的。不
知道怎么对人凶,估计凶起来人家也能看出来我就是个纸老虎。小黑就是拖着活不干,
在老板面前说得非常辛苦,老板也拿他没辙。我成天都看不到他人,听他忽悠老板,都
替他脸红。可又不想去揭发-损人不利己,伤rp啊。
s******9
发帖数: 283
11
来自主题: Biology版 - Pac Bio 的技术怎么样?
从技术上讲,我觉得DNA nanoball(rolony)比DNA cluster(polony)在测序上有先天不
足,而且sequence by ligation限制了read length。
所以现阶段能让Illumina有压力的还是Ion Torrent,Illumina正在研发的技术融入了
Ion Torrent的一些东西。
s*******n
发帖数: 37
12
最近做了一个small rna library(~40-60 bp),adaptor ligation, cDNA ,PCR,
gel purification 做的都没问题,在送去大规模测序前想做个Topo-TA cloning, 先挑
几个克隆测测,做了两次都没什么真的克隆,也就十几个,不知道板上有没有人有这方
面的经验。谢谢。
s********8
发帖数: 619
13
现在PCR了一个8k的片段,要blunt end克隆到pBluescript里去(ECoRV digested),应该
用什么ratio呢?大家都说应该3:1或更多,但是我的载体才3k,insert 8k的话,到底那个
算insert,那个算vector 呢?理论上难道不是1:1最好连吗?
先前做了一个5k的blunt end clone,用的是3:1ratio,似乎没连出来.克隆倒是长了一些
,不过貌似没有insert.(我做了colony PCR).
请克隆牛人赐教!
z*******o
发帖数: 1794
14
小片段往大载体连,用3:1甚至更多。
大片段往小载体连,反之。
你这种情况效率会比较低,最好别用blunt end,如果能够找到合适的enzyme,两个粘
末端的酶会好一些。
n***w
发帖数: 2405
15
可以多设几个ratio。
s******s
发帖数: 13035
16
我都随便混混,这种PCR浓度高的一般总是能连出来的。
你假阳性太多,可以考虑CIP/SAP处理一下vector, PCR加个5p?
s********8
发帖数: 619
17
vector是用SAP处理过了的,对照板上也长了些, 似乎没有弄干净.我换个ratio试试吧.
再不行就重新订引物加酶切吧.看来blunt end没那么好做呀!
s********8
发帖数: 619
18
有道理,刚才看了看sequence,可以用的酶挺多的,还是加酶切位点吧.一开始没加是因为
想做TA克隆来着,结果没做出来,一查发现TA克隆大片段效率也是比较低的.唉唉,从一开
始就打错了算盘,还是没经验呀!
s********8
发帖数: 619
19
PCR加个5p?从没听说过这个,怎么操作?
s*******q
发帖数: 81
20
我一般都用4:1或6:1
除了vector SAP 去磷酸化,还可以对insert磷酸化以增强效率
s******y
发帖数: 28562
21
对于vector 和 insert的理解不是按大小而定的。
其实因为抗生素(或者其他什么用来做选择的)基因以及各种乱七八糟用
来扩展的因子等等都是在vector上的,所以没有连上vector的片断都不能
在细菌里面扩增。
所以包含抗生素和那些扩展因子的都是vector,再小也是。
不包含这些的就是insert, 再大也是
s********8
发帖数: 619
22
多谢艳阳天mm指点,那么我还是应该多加PCR产物喽?怎么跟二楼的同学说的相反呢?到底
那个操作是正确滴?
c***3
发帖数: 527
23
PCR 片段有加 Pi 吗 (T4PNK 处理)?假如 CIP vector (通常是必须的,否则效率
太太低)。
s********8
发帖数: 619
24
刚刚意识到我应该磷酸化PCR产物.从没做过blunt end克隆的我真有够土啊!
哪位好心的同学给个简单的protocol?
z*******o
发帖数: 1794
25
貌似不矛盾吧。我没有说小片段就是insert,大片段就是vector阿。是否生长取决于带
有抗性基因的vector片段能否环化,而能否环化的关键是vector和insert能否连上。我
的理解是,在连接的这个阶段,只是碱基的连接,和vector上面的东西关系不大,那些
东西是用来扩增的。如果只考虑连接的话,你觉得vector和insert有什么区别么?无非
就是两个线性DNA进行环化而已。粘末端的连接效率显然比平端的效率高,所以建议楼
主试double digest。
s********8
发帖数: 619
26
多谢大家指点,现在试试T4PNK,做不出来的话就换引物加酶切位点.我会回来update的.
s******s
发帖数: 13035
27
PNK或者直接合成带5p的引物?
s******y
发帖数: 28562
28
在我的理解中,多加PCR产物肯定是不会错的,因为多加了PCR产物,坏处最多就是
他们自己连接起来,但是反正他们不能在细菌里面扩增,奈何不了你。
但是多加了vector, 就会增加vector 自己链接的风险,增加产物的伪阳性比例
另外一点大家说得非常对,就是必须把insert磷酸化, vector去磷酸化
z*******o
发帖数: 1794
29
在单酶切,并且是vector不去磷酸化的情况下,多加PCR产物肯定没有问题。但这样的
条件谁也不会去做连接,vector自连的风险太高了,就算运气好进去了还有一个正反的
问题。如果是两个酶totally digested呢?原则上说vector将不会存在自我连接的风险
,同时这样的连接无论vector还是insert都是定向的高效连接。
A*******e
发帖数: 284
30
我也一直觉得自己没有真正搞清楚这个连接比例的问题,正常的情况下比较好做克隆也
就不顾这些了,但碰到一些极端情况,如极大或极小的insert,就觉得难了。假若我不
告诉你那个是载体,那个是片段,告诉你需要将两个DNA分子连接起来,该取什么样的
摩尔比。
单梅切若载体不去磷酸化,基本没有成功的可能。最好双酶切的策略。这种8kb的片段
比较大,很难克隆的。 另外我觉得产物纯度很重要,尤其是胶回收的产物,每次测得
时候总发现260/230的比例不够理想,所以觉得这种回收产物最好不要加太多到连接体
系里面。实际上我也发现胶回收的片段加多了就会连接不好
s******y
发帖数: 28562
31
但是反正多加insert 是肯定不会出问题的:)因为反正他们就算自己链上了
也奈何不了你
所以为了保险以见,这个insert, 多多益善
z*t
发帖数: 863
32
单酶切条件下insert磷酸化+vector去磷酸化能把自连降到多少?
现在想把一个cDNA subclone into another vector,但目的vector只有两个酶BamHI和
MluI可以切,并且BamHI还会在cDNA内部有一个切点。。。除了单酶切,我还有什么办
法么?
n***w
发帖数: 2405
33
也不一定必须磷酸化吧。。。
b******n
发帖数: 4225
34
呵呵,那可以这样,先BamHI单酶切连接PCR产物的一部分
(外面的BamHI位点设计成BglII)
然后再MluI和BamHI双酶切连接PCR产物的另外一部分
PCR产物 MluI-BamHI-BglII
先克隆BamHI-BglII片段进入BamHI消化的载体
得到正确克隆之后再克隆MluI-BamHI进去
这个缺点就是没法转移到另外一个载体上去了
C*******e
发帖数: 4348
35
个人觉得TA clone不咋好用
TOPO blunt end很好用,注意要买II,不是I,I还是要用ligase的
TOPO blunt end II就是PCR产物直接跟vector室温混半小时
然后transfer
s********8
发帖数: 619
36
我的回收产物应该还是比较好的,260/230挺高,应该没有什么salt contamination.现在
已经pnk treat了纯化的PCR产物, 试一下3:1 blunt end 连接.如果不成功的话我就重
新订引物双酶切了.下次还是尽量不要做blunt end 克隆了.
s********8
发帖数: 619
37
vector去磷酸的话,insert就必须要磷酸化了, 如果是PCR产物的话.这个我也是才搞明
白滴.
s********8
发帖数: 619
38
头一次听说topo blunt end呀.这个你最大连过多大的片段?
h**********r
发帖数: 671
39
在此拜过克隆达人,跪求葵花宝典。
我正好有个克隆要做,就是teminator-promoter-ORF-terminator.
一看酶切位点设计的正好是:
pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
片段都不大。
请问葡萄MM,我这个能crazy一把吗?我做克隆也是身经百战了。
直接切PCR产物就OK了吧?
多谢!
实验成功,必有包子酬谢!
h**********r
发帖数: 671
40
以前就想到那个yeast homologous recombination了······
C*******e
发帖数: 4348
41
11-12 kb
不过这么大的我是PCR纯化过的
一般的只要跑胶是一条带,不用纯化直接用
还用这个做过3‘race的最后一步
(就是说不是一条带,是一个混合物)
h**********r
发帖数: 671
42
谢谢菩提!
我马上开干了,图已经画好打印放在桌子上了。
我只有自制的top10.
C*******e
发帖数: 4348
43
自制还是买无所谓
用电转化就行
效率高点
n***w
发帖数: 2405
44

如果insert是sticky ends呢。
n***w
发帖数: 2405
45
+1
好厉害
h**********r
发帖数: 671
46
菩提MM,开个公司吧,给版友干点儿私活儿也行。建议业务如下:
1. 只做四个片段以上的链接(注:不含载体);
2. 只做15kb以上的PCR及克隆;
3. 专治各种克隆不适;
4. 欢迎补充。
谢谢!
C*******e
发帖数: 4348
47
倒是想开公司
不过开你说的这种公司太吃力不讨好了:)
哦,两年前好像有人在这里贴广告要找人做克隆的
一个克隆才出价100刀,还要10天内出货
我想了一下觉得实在不划算
j****x
发帖数: 1704
48
hehe,没错,太不划算了
genescript这样的苦力公司,一个最最简单的subcloning还要差不多200刀呢
S******l
发帖数: 14311
49
可以直接用Mlu----BgII 策略(BglII和BamHI是同尾酶)。考虑到将来可以切下来,还
可以在BglII内侧加其他酶切位点。
z*t
发帖数: 863
50
got it! That's a great idea!
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