c********n
发帖数: 225 | 1 【生物界的“坏小子们”】（二）PCR
三十几年以前，1983年，Kary Mullis 发明了Polymerase Chain Reaction
（PCR）。
这是一个disruptive technology。
生物研究领域被拓宽了，也影响到了人们生活的各个方面。
n年以前，大学秋季刚开学的时候，有这么一个讲座。
幻灯片投影的大屏幕上是一张意大利某教堂的地砖图案。
“See，the Double Helix has always been there！”
演讲者不停的前后左右摇摆着，一只脚还在 “一二三”，“一二三二一” 不断
变换的踩着节拍。他穿着一套有点别扭的深蓝色西装，里面是件浅蓝色衬衣，
没有打领带，领子就这么随意的竖起来。他的眼睛里时不时发射出一点“闪
闪”的光，随意的扫一扫满满的几百人的阶梯教室。
不管以前有没有读过有关他背景的信息，看到这么一个人，站在这么一个正式
的Scientific Seminar的讲台上，都会震惊一下 - 这真就是Kary
Mullis，inventor of PCR， 诺奖获得者？
接下去，Kary Mullis 谈到了他如何在高速公路128上... 阅读全帖 |
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q*****d
发帖数: 445 | 2 最近要做library, 使用这个实验室的方法进行易错PCR
（http://www.msg.ucsf.edu/agard/Protocols/PCR_Random_Mutagenesis.htm），酶
是NEB的Taq,但是效果一直不是很好，35 cycle PCR的浓度还是很低，30cycle特别的少
，请问
大家有什么方法提高产量吗？还是我的方法不够好，谢谢大家。
PCR Random Mutagenesis
Materials
1. Parental plasmid
2. Oligos surrounding region to be mutagenized
3. Error-prone PCR buffer (10x is 100mM Tris-HCl, pH8.3; 500mM KCl,
70mM MgCl2, 0.1% (w/v) gelatin.)
4. 10mM MnCl2 (stock) (make sure there is no brown coloring to
stock soln; if there is it means... 阅读全帖 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 3 各位同仁，
本人最近纠结于这个技术问题：怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR，
以达到纯化和增强目标产物的目的？
两轮PCR用的是同样的引物（不是巢式PCR）。本人原先以为，第一轮的PCR产物已经相
当多了，而且和引物百分之百互补，虽然条带暗些，但是稍微拿那么0.几ul出来，怎么
也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意，即便尝试优化条件也不见明显改善
。经过多次试验，我发现用原始引物做第二轮PCR，效率很低，往往失败；而用巢式引
物却几乎都能成功。样本有限，感受未必客观。
在此向请教各位有经验的同仁：用原始引物做第二轮PCR，果真效率很低吗？有什么办
法可以提高这样的PCR的效率呢？什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢？
多谢大家！ |
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s*******e
发帖数: 23 | 4 no,
however,
I am not sure whether you are talking about quantitative real-time PCR
or reverse transcription PCR.
For real-time PCR, no matter how many cycles you run, you are caculating
from the cycle number that first give a significant PCR signal. So
it doesn't related with your total PCR cycles. Although you may set your
PCR reaction to 35 cycles, if your PCR give a signal at 18 cycle number,
that is linear before 18 cycles.
For reverse transcription PCR, if you care about linear range, don' |
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G*****h
发帖数: 320 | 5 2-kb with 44% GC should not be too difficult. Below are what I can think of
at the moment:
1) There may be a very difficult secondary structure in the sequence (such
as an inverted repeat). If there is
indeed an inverted repeat, you have to run two separate PCR and then ligate
your two product together.
2) Some other secondary structure problems can be resolved by designing
longer primers, so you can have a
higher annealing temperature to overcome the problem.
3) Your template DNA is degraded, s... 阅读全帖 |
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s****n
发帖数: 234 | 6 Microwave method
(Use this for checking integrants)
Smear fresh colony using pipette tip on bottom/walls of a small PCR tube.
Microwave PCR tubes or strips (without lids) for 90 sec in PCR rack.
Resuspend dried out yeast in 25 ul of PCR reaction mix (with Taq already
added) and perform PCR.
Note: Do not overload PCR rack when microwaving--no more than 3 strips
of 8 tubes per microwaving or heat dispersal becomes an issue.
Alkaline lysis method
(Use this for cloning or for checkin... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 7 PCR永远不会纯，如果是sanger测序法，你一条500的，和一条250的，都会形成sanger
测序的产物。最好你酶切完了跑完胶之后，再nest pcr一下，这样你的酶切断的DNA就
不会形成带，终产物就纯了。而且你没发现pcr都会形成一条亮带么，那就是乱七八糟
的扩增出来的东西。
不过，如果你要用这种方法，不要用35 cycles的终产物稀释n倍，用十来个cycle的产
物，不要跑胶，直接拿去切，切完了直接nest pcr，然后跑胶纯化nest pcr的产物。这
样是为了防止你的pcr造成几个突变分子，而你稀释太多倍就很可能恰好碰到那几个突
变分子。
我们做过类似的测序，不过我们没有酶切这一步。所以酶切这一步是我理论上觉得应该
是这样，如考虑不全面请指正。但是其他的nest pcr和减少cycle都是我们做过的。 |
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Z*********i
发帖数: 3422 | 8 PCR的FRAME也是FORGED,以下是CZ-USA网站PCR的介绍 （http://www.cz-usa.com/products/view/cz-75-d-pcr-compact/）：
The PCR is identical in size to the CZ 75 Compact, but thanks to its forged
aluminum alloy frame it weighs in at a full 1/4 pound lighter, making it
more comfortable for everyday carry. Equipped with a decocking lever, the
PCR is designed to be decocked before holstering. After decocking, the
trigger safety is much like that of a double action revolver. While there is
no need to flip a safety lever of... 阅读全帖 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 9 Single Molecule PCR是不是就是emulsion PCR啊？我记得好像有文章用过这个名字的
，也有叫digital PCR的。
大概就是把PCR mixture通过emulsion的方法partition到很小的compartment里，在
emulsion里就是悬浮的单个液滴。通过控制起始template的量和合适的emulsion配比，
可以控制每个compartment里只有最多一个template分子。这样每一个compartment里的
PCR反应都是从单分子开始扩增的，所以叫单分子PCR。 |
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C******r
发帖数: 790 | 10 克隆质粒没那么简单吧
说说我碰到的问题：
要把0.5k，2k和4k的3个片段依次插入一个载体质粒
3个片段都是PCR产物
0.5k的两端用A酶切序列引物，很顺利通过酶切——连接进去了
然后PCR的到2k的片段，两端引物用的是B酶切序列
1、B酶切质粒载体和PCR片段，直接连接，长的菌落做酶切，重复了几次，筛了可能上
百个，都不是
2、试图把2k的PCR片段先连到TopoTA vector里，诡异的是，即使白斑做筛选，仍然是
垃圾菌落，没有想要的片段
以上2种方案换个人做，也没做出来
与此同时，4k的PCR产物往TopoTA里面连，一次就连成了。说明TopoTA的kit并没有问题
。试了不同公司的2k片段的primers，都是能PCR出一条2k的很干净的条带，但是竟然连
TA vector都进不去。
不得不感叹：真是见鬼了。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 11 最好两端不用同一个酶，
克隆质粒没那么简单吧
说说我碰到的问题：
要把0.5k，2k和4k的3个片段依次插入一个载体质粒
3个片段都是PCR产物
0.5k的两端用A酶切序列引物，很顺利通过酶切——连接进去了
然后PCR的到2k的片段，两端引物用的是B酶切序列
1、B酶切质粒载体和PCR片段，直接连接，长的菌落做酶切，重复了几次，筛了可能上
百个，都不是
2、试图把2k的PCR片段先连到TopoTA vector里，诡异的是，即使白斑做筛选，仍然是
垃圾菌落，没有想要的片段
以上2种方案换个人做，也没做出来
与此同时，4k的PCR产物往TopoTA里面连，一次就连成了。说明TopoTA的kit并没有问题
。试了不同公司的2k片段的primers，都是能PCR出一条2k的很干净的条带，但是竟然连
TA vector都进不去。
不得不感叹：真是见鬼了。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 12 我不知道你说的“不纯”是指那种情况：1。PCR产生的non-specific product,大小也
和specific产物一样；2。就是我说的那种一个DNA分子的两条链不match,一条是mutant
, 一条是wt。
前者有strategy可以对付：另用一个specific的sequence primer，而不用PCR里用的两
个primers之一。你说的Nested PCR思维上基本差不多，也可以，就多一步PCR。
后者是我担心的，nested PCR不能解决我的问题。我的mutant和wt用同一个非PCR的
specific sequencing primer。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 13 转贴来源于：
http://www.genechina.com/news.php?id=577
http://www.sciencenet.cn/m/user_content.aspx?id=29704
核酸体外扩增最早的设想
本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，1971年，Khorana及
其同事提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该
过程便可克隆tRNA基因。”但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(
1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana
等的早期设想被人们遗忘。
聚合酶链反应的发明
直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人才发明了具有划时代意义
的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),使人们梦寐以求的体外无限扩增
核酸片段的愿望成为现实。1993年，Mullis等人因发明PCR而获得了诺贝尔化学奖。
PCR背后的故事
其实PCR技术诞生的背后还有一段故事。PCR的发明人，一般公 |
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z*y
发帖数: 84 | 14 已有现成的primers和已经建立的试验方法，但是其中的PCR是普通PCR。组里以前的工
作即使用普通PCR，仍然能够清楚的反映出所比较样品的差别。而我现在这次不行，一
是可能本来就没有差别，也可能是差别不大，比如＜10倍的差异，这时普通PCR就不能
有效的反映出这种差异。所以我想有没有定量PCR的方法，利用已有的primers来检测两
个样品间是否存在差异。
看来好像不行。不过还是谢谢楼上两位。 |
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z*********8
发帖数: 1203 | 15 我别的都跟你说的那样做的，只有pcr我跑胶看到都是单条带，所以就只有 column
purification。你觉得是我没有割胶纯化的问题么？？
发信人: N2 (Huahua), 信区: Biology
标 题: Re: 怎样用infusion kit克隆多个PCR 片段？？
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Jul 26 17:52:12 2011, 美东)
It should work. This kind of method is very efficient. Here are some points
maybe be useful.
1) Gel purify you PCR product.
2)use Nanodrop to estimate the concentration of your PCR products
3) add all fragment 1:1 ratio to vector. Add 100-200ng vector part. It also
depends your fragment size. you may add up to 5... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 16 Exactly,
Please go to
//www.biotechniques.com/multimedia/archive/00010/01315rr05_10077a.pdf
it shown that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers
and that this triplex PCR can be performed simulta- neously with a universal PCR assay for the detection of
Cre transgenes.
[回复]
[ 8 ]
发信人: robin95 (robin95), 信区: Biology
标 题: Re: 请教用REAL－TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是－／－ 还
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Feb 16 11:31:37 2012, 美东)
>非常感谢啊， 那就是说要３个PRIMER 一起加， 而不是像普通PCR 那... 阅读全帖 |
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b******r
发帖数: 111 | 17 I am struggling for testing primers to genotype transgenic mice. I use test
1fg of vector as template mixed with 1ng of genomic DNA,
1. PCR always works when the template contains 1fg of vector but no genomic
DNA.
2.PCR always doesn't work when the template contains both 1fg of vector and
1ng of genomic DNA.
PCR conditions: 25 uL volume, pfu enzyme, 95 for 25",65 for 25",72 for 2'.
product size 1kb
Any solutions to fix this problem? Any PCR enzyme is able to PCR 1 fg of
target gene from genomic... 阅读全帖 |
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d**********9
发帖数: 981 | 18 想将两段不相连的片段通过overlap PCR连接在一起，但是以前没有做过，谁有比较详
细的protocol？
是在普通的PCR之后，再将两段PCR产物extension，然后再用两端的PCR引物作普通的
PCR？无比感谢 |
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D*a
发帖数: 6830 | 19 http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31538099.html
你的细胞少，少加点mix，减少一点digestion时间，比如2hours
先做做pcr 看看行不行。
pcr不行的话，一般是dna太稀了（mix加太多），或者digestion时间太长了。
用nested pcr测序
现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2,
XNAT2R
没测过序，但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 20 如果PCR的template里包含WT和mutant（十来个Nt不一样，包含一个酶切位点。），PCR
出来的产物有1Kb，mutation就在这个PCR产物的中间。PCR产物用这个酶切后，上gel,
mutant都是两个片段，跑得快；WT没切该不变。分离这些片断就可以sequence.
问题是，就算酶切完全，WT那个band里面会不会有一条链是WT，一条Mutant的DNA分子
？而这样的DNA正好不能被酶切。因为两条链差别不大，在PCR的变形/退火过程里可能
形成这样的一条链是WT，一条Mutant的DNA分子。这样送去sequence,这个WT可能因此不
能被confirm?
碰到了上面的问题，还在为是不是酶切不全，还是这种一条链是WT，一条Mutant的DNA
假设而烦恼。 |
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n******e
发帖数: 89 | 21 可能是overlapping PCR，同源DNA在vector和基因组里面都有，两个不相干的DNA分子
粘在一起放大了。用过一个PCR enzyme特别好，也发生过这个现象。不好的PCR enzyme
不会发生。降低PCR的循环数会去除这个overlapping PCR。 |
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U*****S
发帖数: 3098 | 22 【 以下文字转载自 Complain 讨论区 】
发信人: wwww (water), 信区: Complain
标 题: [投诉]pcr用昵称PA
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Mar 9 19:30:24 2010, 美东)
投诉人(ID):
wwww
投诉对象及职务(限版主）:
pcr
投诉标题:
pcr用昵称PA
投诉目标(更改处理决定/更改板规/弹劾板主...):
更改昵称
投诉理由及证据:
pcr(wwww是sx装x到极x的jx) |
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p*r
发帖数: 5516 | 23 【 以下文字转载自 sysop 讨论区 】
发信人: pcr (4w是sx装x到极x的jx全家xxx), 信区: sysop
标 题: Re: wwww 封 pcr 在 Military 版 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Apr 4 17:00:20 2010, 美东)
发信人: pcr (4w是sx装x到极x的jx全家xxx), 信区: Complain
标 题: Re: wwww 封 pcr 在 Military 版 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Apr 4 17:00:04 2010, 美东)
既然是攻击版主就应该是pa，咋优势干扰版面秩序呢
既然wwww说sx不是人身攻击，俺说他sx又咋是攻击版主呢
既然wwww说在版面说丫要封，还以此为理由封过n个id
现在俺提醒wwww有人在版面说丫，这个sx的wwww为啥要封俺呢？
转风你为啥非要这么个sx的wwww做军办版务呢，要求丫立刻下台 |
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s*******n
发帖数: 12995 | 24 看来我是老皇历了。
”
FINALLY the PCR is also forged
« on: May 26, 2010, 12:48:43 PM »
I have been emailing the factory for some time regarding the P01/PCR forged
or cast discussions. They must have finally decided I was serious and sent
replies. My questionS and the replies are below. Look for both.
"Please answer our age old question regarding PCR and P01 frames. Are they
cast
or forged alloy. Could be posted in the CZ forum where the question comes up
very often. I think it hurts the sale of... 阅读全帖 |
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h***e
发帖数: 20195 | 25 【 以下文字转载自 Complain 讨论区 】
发信人: wwww (water), 信区: Complain
标 题: [投诉]pcr用昵称PA
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Mar 9 19:30:24 2010, 美东)
投诉人(ID):
wwww
投诉对象及职务(限版主）:
pcr
投诉标题:
pcr用昵称PA
投诉目标(更改处理决定/更改板规/弹劾板主...):
更改昵称
投诉理由及证据:
pcr(wwww是sx装x到极x的jx) |
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s******t
发帖数: 15 | 26 【 以下文字转载自 EE 讨论区,原文如下 】
发信人: surmount (我是一片云), 信区: EE
标 题: MPEG2 PCR 的问题
发信站: The unknown SPACE (Wed Jul 31 21:02:14 2002) WWW-POST
mpeg2中的pcr是从哪里读出来的？
我查了ts流的头格式，里面没有pcr域啊
怎么有的书上又说是42位有效码字？
那么这个pcr到底是在系统的什么地方读出来的
还是ts流的头信息里带的？ |
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b*z
发帖数: 48 | 27 there are so many things that can go wrong in a pcr expt. your purpose would
be defined to carry out an expt without appreciable contamination rather
to figure out what has gone wrong.
typically if you want to find what's wrong, you would change one variables
(any buff, pcr station, even a pipette can be considered a single varibable)
at one time, repeat pcr expt and figure out what has gone wrong.
I would not do that though. you only have to figure out whether your own pcr
station has contamina |
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n*******e
发帖数: 27 | 28 biz is a master guy on pcr. i have a little to say. i have been using
tail DNA for pcr characterization of mice KO. my experience is that
u should separate all the reagents/pippets/pippetmen from commonly
used stuff. so, first of all, go to clean the pcr station, and make it
as clean as possible. remember, always NOT to bring template to the
station. also, get pcr buffer/ddH2O changed frequently if u question it.
primers should be stocked as 100uM, and u may only aliquot them for use.
use filter |
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r****o
发帖数: 105 | 29 1 design primers of ~30 bp length.
2.Use good polymerase to do PCR (herculase from stratagene is great,
a Pfu with special buffer in it to increase the fidelity)
3. add 1~3 ul Dpn I directly to the PCR reaction tube. digest it
for at least 3 hours in 37 degree
4.Desalt the PCR sample with PCR purification kit from Qiagen.
5.Transform competent E.Coli.
6. Pick up several colonies , grow small cultures and do miniprep.
7. Send the DNA to sequencing. |
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r****o
发帖数: 105 | 30 1 design primers of ~30 bp length.
2.Use good polymerase to do PCR (herculase from stratagene is great,
a Pfu with special buffer in it to increase the fidelity)
3. add 1~3 ul Dpn I directly to the PCR reaction tube. digest it
for at least 3 hours in 37 degree
4.Desalt the PCR sample with PCR purification kit from Qiagen.
5.Transform competent E.Coli.
6. Pick up several colonies , grow small cultures and do miniprep.
7. Send the DNA to sequencing. |
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c*******o
发帖数: 8869 | 31 digestion of PCR product can be very tricky, what i do is following:
1 purify your PCR product with qiagen kit
2 use T4 PNK phosphorylate your PCR product's blunt end
3 ligate your blunt PCR fragment into any vector cutted with blunt end enzyme
(like EcoRV)
4 transformation and mini prep plasmid
5 then use hindIII and EcoRI cut the fragment out of vector
6 purify your hindIII-EcoRI fragment with kit and insert it into the vector
you want to use
this will add one more subcloning step but i am sur |
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t**s
发帖数: 284 | 32 I have been working on splicing of a weak intron for some times.
When I tried to measure the portion of spliced mRNA by RT-PCR,
I actually observed similar phenomina as you got here.
In my assay, I place 2 primers around the intron (89bp) to run RT-PCR,
hoping that by measuring the ratio of the two PCR products (spliced
and unspliced) on agarose gel, I could get the efficiency of the splicing.
But we found that is not really true. When we compare PCR assay with
RNase Protection Assay, obviously |
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q******g
发帖数: 3858 | 33 我先用普通PCR做了一个gradient temperature,得到了我想要的产物170bp. 但我做
real-t PCR的时候,得到的产物却是100bp以下.我以为是dimer,于是提高了2度,但还是
得到100bp以下的产物.pcr 和real PCR的试剂和条件一样,除了第一个没有加
sybergreen.很奇怪为什么会这样? |
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f*********r
发帖数: 1233 | 34 目前有两个建议：
1）改用楼上说的rt-pcr专用的带sbgr的master mix试一下，把sbgr对扩增的影响降到
最低。如果仅需要少量的master mix，可以打电话给公司要一点free sample试用。
2）把两种pcr都在rt-pcr机器上跑。消除不同机器不同program对产物的影响。如果有
条件，在rt-pcr时，跑一下melting curve，可以粗略看出产物的质量和特异性。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 35 乘着这会儿人气高，求教一个PCR中遇到的问题哈，说实在的这是第一次遇到这么诡异的PCR问题，
这么多年下来大大小小各式各样的PCR都做过，扩增大于10kb都没有遇到过不知道如何trouble
shooting的时候。
最近从某个E.coli plasmid里PCR一个非E.coli的origin X(这个plasmid既有Ecoli的
origin又有另外某个细菌X的origin X，既可以在E.coli里维持也可以在细菌X里维持)。这个
origin X有3.6kb长，照理说用plasmid做模板，3.6kb也不算多长，应该不会太麻烦；可是做下
来跑胶就是干干净净，没有条带，没有primer dimer，没有非特异产物，什么都没有（当然如果模
板plasmid加多一点，能看到模板）；annealing温度梯度，还有别的optimize都做了，还是一
样；还有过用linear plasmid做模板，还是一样。
另外还设计了这个3.6kb区域的5个sequencing primer，因为一直P不出来，就有点怀疑这个
E.coli plasmid，因为是别的实验室给我们的，送去测序以后没有 |
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b******n
发帖数: 4225 | 36 可能咱们追求的目标不太相同
我想如果是那个shuttle vector能正常work的话（也就是两个细菌都能正常复制）
说明上面两个origin都能work的话
那么你弄清楚这个细菌x来源的origin是什么你才知道你设计的引物是不是对的
我知道你是根据文献报道设计的
现在是你的PCR不能扩增出来那么很可能是引物和模板不配对
引物你确定没问题，那么可能是模板出了问题
所以我让你去测序那个origin啊
加样孔不干净你把模板DNA酚氯仿抽提酒精沉淀一下可以了
不是大问题
我不认为PCR没结果不是因为PCR本身，
因为 1) PCR太常规了，出错机会很小，而且容易设立对照排除
2) 你设计的引物直接测序测不出，无论是E.coli来源的质粒还是细菌x来源的质粒
我个人觉得现在问题指向的是模板 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 37 谢谢这么详尽的trouble shooting
1. 限制性内切酶切E.coli plasmid显示，根据我们手上有的序列信息，如果只切E.
coli源的那
一半，酶切图谱就是正确的；如果在细菌X的origin那一段序列也切，酶切图谱就不能
完全吻合。所
以现在已经放弃用那个E.coli plasmid。
2.这个E.coli plasmid，同一管样品，别的人做PCR，还有ligation，酶切等等（都在E
.coli
源的那一半）是完全没有问题的，所以排除E.coli plasmid不够纯的问题。
3.同样的PCR master mix，用不同模板、引物，是可以PCR没有问题的，所以和试剂没
有关系。
4.引物序列等等已经确认过很多次；不过我没有确认到底有多少DNA在里面，谢谢提醒
，回头会查查
看。
5.要扩增的序列GC%是60%，不算特别高。PCR enhancer等等也试过，没有帮助。
6.我还提到如果不加DNA聚合酶的话加样孔里就没有东西；后来试过酚氯仿提取、乙醇
沉淀，再跑胶
只有一点smear，所以现在确定那是蛋白+核酸在孔里；为什么同样的master mix做别的
P |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 前两天讨论的时候涉及到了PCR, 让我又想起了Mullis这个惊世骇俗的家伙，
色彩斑斓的人生，智力惊人，天生浪荡不堪，一个星期就随便写出了一篇
和他的专业完全无关的Nature 文章从而得以毕业，在公司里经常不务正业，
根本就不把公司交给他的任务当一回事，性欲惊人，甚至在实验室里召妓，
等等奇怪的传闻。
所以就重新上网翻出来这些八卦，大家来乐一乐吧。
要指出的是，Mullis 发展出来的PCR 技术其实根本不是公司交给他的任务，
公司是让他发展合成引物的技术。但是Mullis 很懒，觉得要合成那么大量
的引物太麻烦了，就异想天开后要发展一个扩展的技术，当时还被很多
人嗤之以鼻。幸好他所在的Cetus公司极为开明（比很多大学还开明），
对这个异常的天才极为容忍，就随便他去胡闹去了。但是这个技术发展的
时候一波三折，因为Mullis 这个家伙散漫成性，根本不把公司当一回事，
所以项目拖了又拖，后来公司受不了了，就让其他科学家去收拾他的残局，
总算把这个东西发展出来了。但是后来就惹出了有关谁是PCR 技术发明者
的争吵。
另外，耐热聚合酶的应用，才使得PCR 技术走进了实际使用。
在此之前 |
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c******r
发帖数: 3778 | 39 很多real-time pcr做的是one-step RT-PCR。中间不用RNase treat。实际上比分开两
步做更准确。
但是一般做one-step RT-PCR多用target specific的primer做RT，呵呵，PCR primer多
数可以直接做RT，算好annealing temperature就好了。如果用random primer或者poly
-A做RT，很容易出现这种多peaks的问题。解决办法就是lz发现的办法。 |
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m***o
发帖数: 272 | 40 刚开始去一个lab，做PCR，最近发现阴性对照组经常有跟目的片段一样大小的条带。用
过不同primer，那个片段就跟我的目的片段一样变。如果是水污染了，但是有些管PCR
就什么都没有。因为做的是5和3’RACE，有时候第一次PCR阴性对照组很干净，在用这
个做nest PCR就有了。感觉如果cycle多用的话，阴性对照组就会出来条带。老板今天
专门强调这是技术问题，还是绝对的技术问题。郁闷的不行，唉，刚开始来这个lab，
感觉这个实验室挺脏，是不是环境不好，但是有些组就什么条带没有。但是阴性对照是
经常有，而且条带亮的快赶上阳性对照了。各位，可能是什么问题呢？谢谢任何建议！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 41 RE:
how to google search within MITBBS Biology branch:
a, go to
http://www.utu.fi/haetietoa.html
b: put the key wrords likes < qRT-PCR pdf >
c, click icon "Hae"
d, found no hint then changed
site:utu.fi
to site: www.mitbbs.com
e, click search icon agan
f. go anywhere you want to go
htp://www.google.com/search?ie=UTF-8%2F&oe=UTF-8%2F&q=写了一个较通俗的RT-PCR
数据计算的简介&btnG=Hae&as_sitesearch=utu.fi#sclient=psy-ab&hl=en&source=hp&
q=qRT-PCR++pdf+++site%3Awww.mitbbs.com&pbx=1&oq=qRT-PCR++pdf+++site:www.
mit... 阅读全帖 |
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z*t
发帖数: 863 | 42 目前在用real-time PCR扩一段基因组上GC rich region,设计了几条引物扩增不同的区
域，普通PCR跑胶没有见到可见的smear或者dimer。用ABI的SYBR green master mix
dissociation curve能见到多个peak，amplication curve也很奇怪。跑胶可以看到
smear和dimer...最简单的方法是换引物。。。但是俺要扩的区域CG含量很高。。。换
了primer估计还会有类似问题。。。
对付high CG常用的DMSO/Betaine啥的，在real-time PCR中有没有类似应用？
求做过high gc real-time PCR的大侠指点迷津啊 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 43 本人正在用一组带有很多含糊的位点的引物做PCR，
比方说：CGRTCAKGATCGWCSATAGC
我也不知道怎么称呼，是“degenerate primer”吗？
我想，在PCR反应体系中，其实只有一小部分引物真正与我的模板相结合，
比如我的引物是：CGRTCAKGATCGWCSATAGC
我的模板序列是：CGATCAGGATCGACGATAGC
里面有四个位点是简并的，所以在引物溶液当中真正与模板完全匹配的引物分子不过是
总分子个数的16分之一。
虽说别的不完全匹配的引物分子也或多或少能够结合，但是总体说来，简并引物的结合
效率要低于正常引物吧。
所以我想，要用简并引物做好PCR，是否需要加多于正常量的引物，以保证溶液中匹配
的分子个数达到正常水平呢？
我在摸索PCR条件。本来引物浓度通常不会当做需要优化的条件之一的，但是现在我打
这方面主意了。
以上是我的猜测，不知真实情况怎么样？请有经验的前辈们指点！多谢大家，新年实验
顺利！ |
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m****n
发帖数: 1066 | 44 1.PCR product is about 200bp. PCR product was run on an agarose gel, cut off
from the gel and purified using a Qia quick gel extraction kit from Qiagen
. The elution buffer doesn’t have EDTA.
2.PCR primers were used as sequencing primers.
3.During the first try, some part of the sequence was readable. The
remaining was mixed with NNNN.
4.During the second try, I redid the PCR and gel-purification. All of the
sequences were NNN. The same sequencing contractor was used.
I like to make some change... 阅读全帖 |
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w********a
发帖数: 324 | 45 搭车问一个PCR的问题：
我用做完的PCR product，作为template，继续做PCR
，想得到更高浓度的产物；但总是不成功。要么干脆没有条带，要么有比较强的
unspecific的杂带。不知道您有什么好的建议。。
我试过用做完PCR的mixture直接作为template，也试过先clean-up一下，或者切胶纯化
一下，都不成功。不知道为什么？
非常感谢。
Scar
assembly
exonuclease |
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H*******i
发帖数: 196 | 46 1.建议换酶（PCR不work这个我觉得比试条件有效），相对phusion PCR困难模板个人喜
欢Q5，在一些primer靠近terminator的情况，我遇到phusion不work但是Q5（NEB说Q5突
变率低，但我觉得Q5似乎突变率高点，不知道是不是错觉）没问题的情况。
2.spec单独为什么假阳性，这抗性我经常用，不理解。。。
3.comp. cell效率我觉得主要还是和制作方法有关吧，转提纯的质粒做测试得话，我用
TSS转 MG1655 BW25113 DH10B（TOP10是商品名吧） XL1blue 没有观察到特别显著区别
（小于一个数量级），当然做克隆或者PCR产物肯定有些区别。 单个人觉得做克隆效率
10^7-10^8足够了，更高的效率如果长出来几个，很可能是残留模板之类的。另外胶上
看不见确实可以接着做，不过大多情况是费时费力（转化鉴定基本要1.5天），所以我
如果觉得PCR完全没东西，基本就换方法了。 |
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S**********g
发帖数: 109 | 47 提RNA--反转录PCR--realtime PCR，在这其中，提完RNA之后，要不要测RNA浓度吗？在
做反转录PCR之前，要把所有RNA样品调正为同一浓度吗？
有人认为不用，因为在做realtime PCR的时候，有内参作对比，所以不用，但有的人还
是说要调正浓度，到底应不应该调正呐？
谢谢 |
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a********k
发帖数: 2273 | 48 100细胞足够了，这是我的protocol，用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
离心下细胞
加纯水20ul
用20ul枪头快速吹打20次
取2-5ul做PCR，20ul反应体系
PCR之前+95度五分钟，然后正常PCR的基础上+5cycles
Exo-SAP 30分钟，取5ul送测序。 |
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a******a
发帖数: 283 | 49 我做了一些，水解细胞，溶液直接加入pcr系统去。结果发现出现的都是假阳性信号。
当然我是读取taqman荧光信号来衡量pcr结果的，不是跑胶。
解释是，nucleases直接切掉probe上的fluorophores，所以出现的荧光信号都是假阳性。
那么对我来说，我这个系统（依靠读取荧光信号来判断pcr结果的）就最好先加tris
buffer和proteanse K来除掉nucleases，再水煮一下样品灭火protease K或者其他的酶
。之后加入PCR系统。
看看怎么样，这个方案可好？ |
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g******r
发帖数: 139 | 50 谢谢你的建议。我知道qPCR的efficiency, 但确实没有测过各个primer的efficiency到
底怎么样。但理论上effiency对Absolute Quantification影响很大，而对ddCT方法的
影响有限。而我就只用ddCT方法比较各个gene在不同条件下的表达，没有去比较基因间
的表达。至于ddCt的方法有人要argue有缺陷，不理想，那是另外的话题 (体外话，我
发现没有测primer效率的人不在少数，当然绝大部分人也是用ddCt)。
以一个简单的knockdown为例，设目标gene表达量为X0，在Ct时的PCR产物为Xt0，效率
为EX, reference gene的表达量为R0，在Ct时的PCR产物为Rt0，效率为ER；在
knockdown情况下目标gene表达量为X1，在Ct时的PCR产物为Xt1, reference gene的表
达量不变，仍然是R0，在Ct时的PCR产物为Rt1 (两次的Ct可能一样，也可能不一样)。
Xt0=X0 (1+EX)CtX0, Rt0= R0 (1+ER)CtR0 ;Xt1=X1 (1+EX)CtX1, Rt1... 阅读全帖 |
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