y******y
发帖数: 107 | 1 想要在一个plasmid A里面加上一个基因的ORF。首先把这个基因用PCR给扩增出来（PCR
两个末端带有特定酶切位点序列 Nhe I和Age I，通过引物加进去的），然后连到pGEM
－T plasmid里面，transform之后筛选。然后用Nhe I和Age I酶切，agarose gel 切胶
纯化这段基因片断。
把plasmid A也用Nhe I和Age I酶切，同样的agarose gel 切胶纯化。然后把切胶纯化
的目的基因和plasmid A连接，transform之后筛选。
1,第一次得到大约10个colony，测序之后发现全部是plasmid A的序列。
2，这次把plasmid A用Nhe I和Age I酶切之后用Shrimp alkaline phosphatase处理，
然后再作连接。这次得到5个colony，简单的酶切鉴定之后发现全部又是plasmid A的。
electro-competent没有问题，做了阳性对照。不知道哪里有什么问题，谢谢。 |
e****s
发帖数: 1125 | 2 Ligation的时候有没有做Vector的对照？对照盘里面有克隆吗？
PCR
pGEM
【在 y******y 的大作中提到】
: 想要在一个plasmid A里面加上一个基因的ORF。首先把这个基因用PCR给扩增出来（PCR
: 两个末端带有特定酶切位点序列 Nhe I和Age I，通过引物加进去的），然后连到pGEM
: －T plasmid里面，transform之后筛选。然后用Nhe I和Age I酶切，agarose gel 切胶
: 纯化这段基因片断。
: 把plasmid A也用Nhe I和Age I酶切，同样的agarose gel 切胶纯化。然后把切胶纯化
: 的目的基因和plasmid A连接，transform之后筛选。
: 1,第一次得到大约10个colony，测序之后发现全部是plasmid A的序列。
: 2，这次把plasmid A用Nhe I和Age I酶切之后用Shrimp alkaline phosphatase处理，
: 然后再作连接。这次得到5个colony，简单的酶切鉴定之后发现全部又是plasmid A的。
: electro-competent没有问题，做了阳性对照。不知道哪里有什么问题，谢谢。
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y******y
发帖数: 107 | 3 没有做对照，应该是做一个对照。现在是不知道为什么colony这么少。直接用plasmid
A做transformation，可以有几百个colony。不知道plasmid的大小对transformation影
响大不大？
【在 e****s 的大作中提到】
: Ligation的时候有没有做Vector的对照？对照盘里面有克隆吗？
:
: PCR
: pGEM
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b***g
发帖数: 516 | |
y******y
发帖数: 107 | 5 目的基因4.8kb, plasmid A 4.7kb。 ligation是用的pGEM－T easy vector的用来测序
的ligation方法，具体是
目的基因 150ng
plasmid A 50ng
T4 DNA ligase 1ul
2xbuffer 5ul
Total volume 10ul,
4C for 16h, 取2ul transformation。
【在 b***g 的大作中提到】
: 你的片段有多大？怎么做的ligation?
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e****s
发帖数: 1125 | 6 估计就是Vector自连了，不知道你有没有用Phosphatase处理过。感觉是目的基因就是
没链接上。
Insert片段多加点没坏处，你从pGEM里切出来的应该酶切的问题不大。
【在 y******y 的大作中提到】
: 目的基因4.8kb, plasmid A 4.7kb。 ligation是用的pGEM－T easy vector的用来测序
: 的ligation方法，具体是
: 目的基因 150ng
: plasmid A 50ng
: T4 DNA ligase 1ul
: 2xbuffer 5ul
: Total volume 10ul,
: 4C for 16h, 取2ul transformation。
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e****s
发帖数: 1125 | 7 估计就是Vector自连了，不知道你有没有用Phosphatase处理过。感觉是目的基因就是
没链接上。
Insert片段多加点没坏处，你从pGEM里切出来的应该酶切的问题不大。
【在 y******y 的大作中提到】
: 目的基因4.8kb, plasmid A 4.7kb。 ligation是用的pGEM－T easy vector的用来测序
: 的ligation方法，具体是
: 目的基因 150ng
: plasmid A 50ng
: T4 DNA ligase 1ul
: 2xbuffer 5ul
: Total volume 10ul,
: 4C for 16h, 取2ul transformation。
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y******y
发帖数: 107 | 8 用shirmp alkaline phosphatase 处理过双酶切plasmid A. 不知道为什么colony这么
少。
【在 e****s 的大作中提到】
: 估计就是Vector自连了，不知道你有没有用Phosphatase处理过。感觉是目的基因就是
: 没链接上。
: Insert片段多加点没坏处，你从pGEM里切出来的应该酶切的问题不大。
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a****d
发帖数: 1919 | 9 Roche dephos and ligation kit works well, try it. |
s***r
发帖数: 4013 | 10 try 目的基因 : plasmid A = 1:1
since your target and vector have similar size |
y******y
发帖数: 107 | 11 这个比例试过，还是一样的。
【在 s***r 的大作中提到】
: try 目的基因 : plasmid A = 1:1
: since your target and vector have similar size
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