O******e
发帖数: 14 | 1 PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
谢谢。 |
I***a
发帖数: 13467 | |
O******e
发帖数: 14 | 3 试过了。加到了原文。
【在 I***a 的大作中提到】
: 换载体试试？
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a***e
发帖数: 1010 | |
a***e
发帖数: 1010 | 5 and how about Gateway system? |
I***a
发帖数: 13467 | |
l*******1
发帖数: 128 | 7 有时DNA有二级结构或者重复之类容易发生重组。试一试SURE competent cells：
http://www.stratagene.com/products/displayproduct.aspx?pid=290
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
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N*o
发帖数: 97 | 8 try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
other) while cloning and finally ligate the two. good luck! |
y***i
发帖数: 11639 | 9 1. 改温度，30度摇菌, 放plate
2. 象你做的，改质粒和细菌。
3. 挑colony时，不但挑大的，也挑些小colony。plasmid有毒性的话，阳性clony 长
得慢。plate 放时间长些，让小colony长大。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
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O******e
发帖数: 14 | 10 stb12? from which company? A simple search brought it to stratagene,but
nothing on their website. Thanks.
).
【在 N*o 的大作中提到】
: try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
: Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
: other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
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t******r
发帖数: 8600 | 11 stb12 is a piece of garbage
).
【在 N*o 的大作中提到】
: try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
: Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
: other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
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N*o
发帖数: 97 | 12
worked for my clone!
【在 t******r 的大作中提到】
: stb12 is a piece of garbage
:
: ).
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X***n
发帖数: 366 | 13 哪一段？可以的话说出来看看。
我也在克隆3‘-UTR，大片段阳性克隆数是比较低，也有你这样的情况。
好在最后都出来了，好像没有不稳定。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
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N*o
发帖数: 97 | 14
just realised it's actually "Stbl2". invitrogen. give it a try maybe?
btw, keeping the insert in two separate plasmids usually helps if ur
sequence has instability problem or is toxic to the bacteria
【在 O******e 的大作中提到】
: stb12? from which company? A simple search brought it to stratagene,but
: nothing on their website. Thanks.
:
: ).
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t****p
发帖数: 1504 | 15 这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
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O******e
发帖数: 14 | 16 是什么菌？还是不管啥strain都可以在<=30度试试？谢。
我的也是有很多重复序列。
【在 t****p 的大作中提到】
: 这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
: 低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
:
: stellar，还有promega的。
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t****p
发帖数: 1504 | 17 top10
其它菌只要是用于抽质粒用的，应该都一样吧。
【在 O******e 的大作中提到】
: 是什么菌？还是不管啥strain都可以在<=30度试试？谢。
: 我的也是有很多重复序列。
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n********k
发帖数: 2818 | 18 have u tried recommendation incompetent cells, never done it myself but I
thought those have been
developed for cloning of this kind...shall be RecA/BCD all minus...
【在 t****p 的大作中提到】
: 这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
: 低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
:
: stellar，还有promega的。
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O******e
发帖数: 14 | 19 Any suggestions other than Sure cells?
Thanks.
【在 n********k 的大作中提到】
: have u tried recommendation incompetent cells, never done it myself but I
: thought those have been
: developed for cloning of this kind...shall be RecA/BCD all minus...
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a**********s
发帖数: 238 | 20 这种情况我以前也遇到过，后来发现把转化时42度热击的时间从30秒延长到45-50秒就
基本解决了。大片段的插入片段在热击时如果时间不够长的话，就会发生missing部分
片段的情况，推测可能是部分末端的DNA来不及进入E.coli。
BTW：你是不是在用TOPO载体？TOPO对于3kb以下的插入片段好像还稳定，大于3kb的片
段就经常出问题，至少在我手上。我后来换了Promega的T-vector就一直很稳定。 |
O******e
发帖数: 14 | 21 两种都用过。大片段延长Heat Shock时间不知啥原理，有人有类似经验吗？
还有个实际问题就是，ligation反应之后放-20度，多久之后仍然可以用来做转化？感
觉如果ligate了，应该很稳定吧。大多数manual说可以overnight，有高手放了几天或
更久之后仍然成功转化的吗？我没试过，纯经验请教。
谢谢。
【在 a**********s 的大作中提到】
: 这种情况我以前也遇到过，后来发现把转化时42度热击的时间从30秒延长到45-50秒就
: 基本解决了。大片段的插入片段在热击时如果时间不够长的话，就会发生missing部分
: 片段的情况，推测可能是部分末端的DNA来不及进入E.coli。
: BTW：你是不是在用TOPO载体？TOPO对于3kb以下的插入片段好像还稳定，大于3kb的片
: 段就经常出问题，至少在我手上。我后来换了Promega的T-vector就一直很稳定。
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