i*********0 发帖数: 915 | 1 不知道怎么回事?
我一般是4%PFA fix 24小时,然后转到30%的蔗糖溶液(in 1xpbs),等到组织沉到底
部的时候的时候,直接取出组织然后用freezing medium包埋,然后用液氮snap freeze。
可是每次在切的时候,都能看到组织有小的裂痕,切的时候很讨厌。
大家觉得我的问题可能存在哪儿?
有没有什么好的方式去做cyro的包埋。 |
s******y 发帖数: 28562 | 2 不知道你说的裂痕有多严重,如果不严重的话好像是正常的,反正成像的时候避开那个
地方就是了。
如果很严重的话,估计是切片机冷冻不够,你们的切片机上有用了液氮的吧?
freeze。
【在 i*********0 的大作中提到】 : 不知道怎么回事? : 我一般是4%PFA fix 24小时,然后转到30%的蔗糖溶液(in 1xpbs),等到组织沉到底 : 部的时候的时候,直接取出组织然后用freezing medium包埋,然后用液氮snap freeze。 : 可是每次在切的时候,都能看到组织有小的裂痕,切的时候很讨厌。 : 大家觉得我的问题可能存在哪儿? : 有没有什么好的方式去做cyro的包埋。
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s******e 发帖数: 370 | 3 需要用液氮吗?
我做到现在都是用干冰的
把组织块放在oct里,放在干冰上5-10分钟就行
有点怀疑开裂跟液氮冻的太快有关 |
H****N 发帖数: 997 | 4 Don't put the samples in liquid nitrogen directly. Use dry ice or put a
mental block (like those from a block hear, but with the flat side up) in
liquid nitrogen and put the samples on the block. Let the samples freeze
slowly. |
i*********0 发帖数: 915 | 5 谢谢了。
切片机上没有用液氮。
我也觉得是液氮冷冻的太快了
还在从30%的蔗糖溶液到OCT转移的时候,要不要remove一下水分,要是组织边缘水分(
30% 蔗糖/1xpbs)太多的话,会不会有这样的问题? |
l******u 发帖数: 936 | 6 切的很慢很慢很慢,就会好很多,依据我切脑组织和肺癌的经验。
freeze。
【在 i*********0 的大作中提到】 : 不知道怎么回事? : 我一般是4%PFA fix 24小时,然后转到30%的蔗糖溶液(in 1xpbs),等到组织沉到底 : 部的时候的时候,直接取出组织然后用freezing medium包埋,然后用液氮snap freeze。 : 可是每次在切的时候,都能看到组织有小的裂痕,切的时候很讨厌。 : 大家觉得我的问题可能存在哪儿? : 有没有什么好的方式去做cyro的包埋。
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s******e 发帖数: 370 | 7 我的做法是把组织块在oct里稍微过一下,混个15-20分钟的样子,再换到完全的oct里
包埋。这样组织与周围的oct连接比较好,切的时候不容易掉下来
【在 i*********0 的大作中提到】 : 谢谢了。 : 切片机上没有用液氮。 : 我也觉得是液氮冷冻的太快了 : 还在从30%的蔗糖溶液到OCT转移的时候,要不要remove一下水分,要是组织边缘水分( : 30% 蔗糖/1xpbs)太多的话,会不会有这样的问题?
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n*****j 发帖数: 261 | 8 觉得只用干冰又有点太慢了,大组织快恐怕不适合。
我是混合干冰和丙酮,或者2-methylbutae,先冻一个oct托儿,然后按照skysmile的做
法将组织块埋到oct里之后,把这个托的底部浸到干冰的液体混合物里,慢慢全部冻上
就好了。
还有包埋前吸干表面水分是挺重要的 |
i*********0 发帖数: 915 | 9 切12um的冰冻切片我觉得确实是慢一点要好,但是切8um的要稍微快一点。
不知道,你有没有切更加thin的片子的经验。
【在 l******u 的大作中提到】 : 切的很慢很慢很慢,就会好很多,依据我切脑组织和肺癌的经验。 : : freeze。
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l******u 发帖数: 936 | 10 从我的经验看,太薄的应该不太适合用冰冻切片吧。你做什么实验?
容易碎裂跟组织本身有很大关系,有些组织就很难切成好看的冰冻片子,比如肺。
【在 i*********0 的大作中提到】 : 切12um的冰冻切片我觉得确实是慢一点要好,但是切8um的要稍微快一点。 : 不知道,你有没有切更加thin的片子的经验。
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s******e 发帖数: 370 | 11 我倒是没有切过10um以下的,但是速度是跟当时切片的条件相关的,很难说该用快还是
慢,要试才行。我一般都用40~50%的速度,算比较快的。
我的感觉冰冻切片会受很多因素影响,比如chamber 温度,object温度,甚至当天的空
气湿度。所以我现在都尽量避免在雨天切片,免得给自己找麻烦。
一家之言仅供参考 |
s******r 发帖数: 2876 | 12 这个chamber温度,object温度一般如何选择?
有没有什么经验规则?
我倒是没有切过10um以下的,但是速度是跟当时切片的条件相关的,很难说该用快还是
慢,要试才行。我一般都用40~50%的速度,算比较快的。
我的感觉冰冻切片会受很多因素影响,比如chamber 温度,object温度,甚至当天的空
气湿度。所以我现在都尽量避免在雨天切片,免得给自己找麻烦。
一家之言仅供参考
【在 s******e 的大作中提到】 : 我倒是没有切过10um以下的,但是速度是跟当时切片的条件相关的,很难说该用快还是 : 慢,要试才行。我一般都用40~50%的速度,算比较快的。 : 我的感觉冰冻切片会受很多因素影响,比如chamber 温度,object温度,甚至当天的空 : 气湿度。所以我现在都尽量避免在雨天切片,免得给自己找麻烦。 : 一家之言仅供参考
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s******e 发帖数: 370 | 13 我比较喜欢object=chamber+4
比如chamber -22,object-18,不过也很难说,不管什么温度只要能切好都行。到后
面几乎就是art了,都是感觉 |
c****l 发帖数: 1086 | 14 chamber温度太低会导致裂痕,太高会卷。我一般用-24-28° |
i*********0 发帖数: 915 | 15 按照这个理论,是不是freeze的过程越慢越好,液氮这种急冻的方法不很科学?
【在 n*****j 的大作中提到】 : 觉得只用干冰又有点太慢了,大组织快恐怕不适合。 : 我是混合干冰和丙酮,或者2-methylbutae,先冻一个oct托儿,然后按照skysmile的做 : 法将组织块埋到oct里之后,把这个托的底部浸到干冰的液体混合物里,慢慢全部冻上 : 就好了。 : 还有包埋前吸干表面水分是挺重要的
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