w******e
发帖数: 1187 | 1 前段时间来求救，做EMSA，连作为negative control的library都bind的一塌糊涂：
http://www.mitbbs.com/article0/Biology/31394721_0.html
得到了大家的很多宝贵建议。综合考虑后觉得自己的protein是形成了aggregate，拖了
n久总算确认
了——见附件图。gel 是4% native PAGE，silver stain，lane 1/2/4是target
protein，
3/5是control（5是homolog，如果没aggregate的话target也该在那个position）。其
中lane
2/4加了0.1%/1%的triton，没区别。另外也试了DTT，也不行。真衰呀。。。
这个target是我side project必须要用的，而且要用大量。好不容易找到家便宜的，还
这么背。。
。还有什么方法可以搞掉这个aggregate吗？更狠的detergent？？请指教！//bow |
I*****y
发帖数: 6402 | 2 try using CHAPS, or reduce the amount of proteins - it's just way too much.
【在 w******e 的大作中提到】
: 前段时间来求救，做EMSA，连作为negative control的library都bind的一塌糊涂：
: http://www.mitbbs.com/article0/Biology/31394721_0.html
: 得到了大家的很多宝贵建议。综合考虑后觉得自己的protein是形成了aggregate，拖了
: n久总算确认
: 了——见附件图。gel 是4% native PAGE，silver stain，lane 1/2/4是target
: protein，
: 3/5是control（5是homolog，如果没aggregate的话target也该在那个position）。其
: 中lane
: 2/4加了0.1%/1%的triton，没区别。另外也试了DTT，也不行。真衰呀。。。
: 这个target是我side project必须要用的，而且要用大量。好不容易找到家便宜的，还
|
w******e
发帖数: 1187 | 3 thanks! I didn't use this much for binding. it's just for staining purpose:)
【在 I*****y 的大作中提到】
: try using CHAPS, or reduce the amount of proteins - it's just way too much.
|
T**********t
发帖数: 1604 | 4 3/5都是什么control啊？你说5是homolog，是你的target protein的homolog么？即使
是近似的蛋白，也不一定在native gel上跑得一样的。还有就是你用DTT处理浓度用了
多少，处理了多长时间？ |
w******e
发帖数: 1187 | 5 3是BSA，5是target的homolog——你说的没错未必跑的完全一样。他们MW和PI都
还接近，我就是要show个类似的protein能成band能migrate其实呵呵。
DTT我只做了一次，加了1mM。不知道还要incubate一阵，土了。。。不过整个
准备过程下来，到把probe加到protein里也已经算处理了近1h吧。然后probe
protein interaction也要1hr+
【在 T**********t 的大作中提到】
: 3/5都是什么control啊？你说5是homolog，是你的target protein的homolog么？即使
: 是近似的蛋白，也不一定在native gel上跑得一样的。还有就是你用DTT处理浓度用了
: 多少，处理了多长时间？
|
T**********t
发帖数: 1604 | 6 如果你的蛋白已经aggregate了，加1mM的DTT还原能力不够的。1mM的话，一般只能起防
止二硫键生成的效果。用来打开已经形成的二硫键的话，你加到5mM甚至10mM再试试，
incubate个半小时到一小时的样子再跑胶。
另外，你的蛋白跑SDS胶是纯的么？
还有就是你的蛋白上样量明显太多了，少加一点。
还还有，上回你问的那个Reverse transcription的efficiency的问题，我帮你问过了
，他们都不做测试的，估计反正library够大。。。
【在 w******e 的大作中提到】
: 3是BSA，5是target的homolog——你说的没错未必跑的完全一样。他们MW和PI都
: 还接近，我就是要show个类似的protein能成band能migrate其实呵呵。
: DTT我只做了一次，加了1mM。不知道还要incubate一阵，土了。。。不过整个
: 准备过程下来，到把probe加到protein里也已经算处理了近1h吧。然后probe
: protein interaction也要1hr+
|
l*******k
发帖数: 361 | 7 你试试 0.1%NP40, 这个浓度不会让蛋白变性，但是可以让通过疏水作用结合的蛋白解
聚。另外，你最好radiolabel DNA或者RNA, 3000-5000cts就够用了，这样你用的蛋白
的量会大大降低 （silver staining检测不出来的量） |
w******e
发帖数: 1187 | 8 非常感谢！
好我再试试
没做这个呢。我以前过分相信厂家了，所有的protein都是买来就用。。。
嗯，我为了找厂家麻烦，特意多load了点，生怕看不到aggregate呵呵
话说我一轮SELEX做下来，最大的感觉就是rp最重要。。。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 如果你的蛋白已经aggregate了，加1mM的DTT还原能力不够的。1mM的话，一般只能起防
: 止二硫键生成的效果。用来打开已经形成的二硫键的话，你加到5mM甚至10mM再试试，
: incubate个半小时到一小时的样子再跑胶。
: 另外，你的蛋白跑SDS胶是纯的么？
: 还有就是你的蛋白上样量明显太多了，少加一点。
: 还还有，上回你问的那个Reverse transcription的efficiency的问题，我帮你问过了
: ，他们都不做测试的，估计反正library够大。。。
|
w******e
发帖数: 1187 | 9 多谢建议。我试过up to 1% triton，没效果。。。
我就是label的RNA。cts是指scintillation counts？我的远超过这个了。不过我要
测Kd，起码要用a few ug/ml protein，这时library已经跟protein打得火热了。。。
【在 l*******k 的大作中提到】
: 你试试 0.1%NP40, 这个浓度不会让蛋白变性，但是可以让通过疏水作用结合的蛋白解
: 聚。另外，你最好radiolabel DNA或者RNA, 3000-5000cts就够用了，这样你用的蛋白
: 的量会大大降低 （silver staining检测不出来的量）
|
T**********t
发帖数: 1604 | 10 蛋白用着没问题当然就不用专门跑SDS看。但你现在不是troubleshooting么，SDS还是
应该跑一个的，步骤简单，也不需要大量样品。
我非常同意做selex的话rp最重要。。。
【在 w******e 的大作中提到】
: 非常感谢！
:
: 好我再试试
: 没做这个呢。我以前过分相信厂家了，所有的protein都是买来就用。。。
: 嗯，我为了找厂家麻烦，特意多load了点，生怕看不到aggregate呵呵
: 话说我一轮SELEX做下来，最大的感觉就是rp最重要。。。
|
