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Biology版 - 请教native page
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请教一个学术问题啊, 蛋白和蛋白团聚物跑什么柱子?which FPLC to buy: Akta (GE) or Duo Flow (Bio-Rad)??
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Contractor postion - Protein purifiecation process development请推荐一个docking program
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作Gel filtration分离蛋白,总是聚集Histone H3可以做nuclear fraction positive marker吗?
相关话题的讨论汇总
话题: monomer话题: tetramer话题: gel话题: 蛋白话题: filtration
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1 (共1页)
i********e
发帖数: 50
1
有个超大蛋白,单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态,是
monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较
monomer/tetramer?
native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话,使用的抗体和
monomer或tetramer结合的效果会有差异吗?比如monomer的结合效果好,band清晰。抗
体和tetramer 反应弱,看不大出来band?
比较奇怪的是,6%的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白
跑出去了?不应该啊.
求高人指点。
a****k
发帖数: 1130
2
可以run gel filtration column

【在 i********e 的大作中提到】
: 有个超大蛋白,单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态,是
: monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较
: monomer/tetramer?
: native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话,使用的抗体和
: monomer或tetramer结合的效果会有差异吗?比如monomer的结合效果好,band清晰。抗
: 体和tetramer 反应弱,看不大出来band?
: 比较奇怪的是,6%的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白
: 跑出去了?不应该啊.
: 求高人指点。

C*******e
发帖数: 4348
3
抗体结合不好说
因为抗体生成的时候用的是变性蛋白
识别的区域未必暴露在表面
T**********t
发帖数: 1604
4
Analytical Ultracentrifugation可以判断monomer/oligomer状态,但是需要的蛋白量
比较大。一个样品体积要大概400ul,absorbance最好在1左右,而且做完基本就废了,
拿不回来了。
m**z
发帖数: 787
5
that's not an easy experiment...

【在 T**********t 的大作中提到】
: Analytical Ultracentrifugation可以判断monomer/oligomer状态,但是需要的蛋白量
: 比较大。一个样品体积要大概400ul,absorbance最好在1左右,而且做完基本就废了,
: 拿不回来了。

T**********t
发帖数: 1604
6
主要是仪器比较delicate吧,容易坏。所以帮我做AUC的那个实验室是有专人负责跑AUC
的,别人只管提供样品,不能插手仪器操作。就这样那仪器还三天两头坏掉。。。

【在 m**z 的大作中提到】
: that's not an easy experiment...
m**z
发帖数: 787
7
对样品的要求也很高,比如纯度,稳定性什么的,因为一转就是十几个小时(velocity)
甚至两三天的(equilibrium).数据处理也不容易.不过对于oligomerization方面的问
题的确是best experiment to do, just not easy...

AUC

【在 T**********t 的大作中提到】
: 主要是仪器比较delicate吧,容易坏。所以帮我做AUC的那个实验室是有专人负责跑AUC
: 的,别人只管提供样品,不能插手仪器操作。就这样那仪器还三天两头坏掉。。。

i********e
发帖数: 50
8

gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结
果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断
gel filtration的fraction比较困难。1,蛋白质量少,很难有peak。2,单体蛋白就
550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著
差异。

【在 a****k 的大作中提到】
: 可以run gel filtration column
m**z
发帖数: 787
9
蛋白量倒是不用担心,这么大的蛋白用A220 backbone absorbance应该只要一点点蛋白
。不过对于一般的gel filtration column来讲,的确太大了

【在 i********e 的大作中提到】
:
: gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结
: 果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断
: gel filtration的fraction比较困难。1,蛋白质量少,很难有peak。2,单体蛋白就
: 550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著
: 差异。

T**********t
发帖数: 1604
10
FPLC看A220 absorbance还要换lamp和filter吧?反正我的FPLC只能看254和280。为了
看这一个蛋白的aggregation买一套lamp+filter,还挺费钱的。。。

【在 m**z 的大作中提到】
: 蛋白量倒是不用担心,这么大的蛋白用A220 backbone absorbance应该只要一点点蛋白
: 。不过对于一般的gel filtration column来讲,的确太大了

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m**z
发帖数: 787
11
ok... 那么大的蛋白,里面trp/tyr应该不少把,也许A280也够了。或者bradford
assay on each fraction, could be done on a microtiter plate and a plate
reader。这个方法也是很灵敏的

【在 T**********t 的大作中提到】
: FPLC看A220 absorbance还要换lamp和filter吧?反正我的FPLC只能看254和280。为了
: 看这一个蛋白的aggregation买一套lamp+filter,还挺费钱的。。。

a****k
发帖数: 1130
12
你不是有抗体的吗,gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
方面的实验,是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
position出来的,monomer和tetramer肯定是可以分开的

【在 i********e 的大作中提到】
:
: gel filtration出来的fraction还是需要别的方法来鉴定。原本是想native page的结
: 果比较可靠后用来检测gel filtration的fractions的。光从分光度来判断
: gel filtration的fraction比较困难。1,蛋白质量少,很难有peak。2,单体蛋白就
: 550Kda,直接从bed volume就跑出来了。很怀疑跟4倍体能有retention time 上的显著
: 差异。

l**n
发帖数: 109
13
或者把蛋白构建成GFP fusion,用荧光检测。

【在 a****k 的大作中提到】
: 你不是有抗体的吗,gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
: 方面的实验,是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
: position出来的,monomer和tetramer肯定是可以分开的

y****m
发帖数: 37
14

glycerol gradient, then western? blue native gel electrophorensis?
did you change to fresh buffer after a while? most likely the running buffer
went bad.

【在 i********e 的大作中提到】
: 有个超大蛋白,单体为550Kda, 细胞里是tetramer。想看一下转基因表达后的状态,是
: monomer/dimer/tetramer.请问除了native page还有什么方法能够鉴别或者比较
: monomer/tetramer?
: native page用了basic-native gel protocol。做western blot的话,使用的抗体和
: monomer或tetramer结合的效果会有差异吗?比如monomer的结合效果好,band清晰。抗
: 体和tetramer 反应弱,看不大出来band?
: 比较奇怪的是,6%的胶跑3个小时和6个小时的结果不一样。难道6个小时后所有的蛋白
: 跑出去了?不应该啊.
: 求高人指点。

i********e
发帖数: 50
15

有抗体,western 没问题。问题是要鉴别是monomer还是tetramer.SDS-PAGE是变性蛋白
,出来的都是monomer了。实验目的是确定蛋白的状态,目前只想到native page 和gel
filtration.
谢谢你关于柱子的建议,打算试一下。可是出来的fraction还是需要别的方法来确定到
底是monomer或tetramer吧。就算出来2个peak,怎么能说是2种不同状态呢?

【在 a****k 的大作中提到】
: 你不是有抗体的吗,gel filtration之后做western就好了啊。最近帮别人做了一些这
: 方面的实验,是可行的。550Kda在superose 6还有superdex 200上都是不会从void
: position出来的,monomer和tetramer肯定是可以分开的

i********e
发帖数: 50
16

谢谢。glycerol gradient要很多蛋白量才可以吧?blue native gel electropheresis
是什么?
buffer
这个的确不知道。非常感谢!不过很困惑,buffer为什么会went bad? PH的改变?

【在 y****m 的大作中提到】
:
: glycerol gradient, then western? blue native gel electrophorensis?
: did you change to fresh buffer after a while? most likely the running buffer
: went bad.

i********e
发帖数: 50
17
请问上面的高人,dynamic light scattering 可行吗?以前做过一点,原理不懂。但
材料可以回收,就是用量比较大,而且要纯化蛋白。
请哪位能给科普一下?
m**z
发帖数: 787
18
yes. you need purified proteins for that. it basically gives you the info of
the size of the particle. you don't need a lot, maybe 10uM of several
hundred ul. I believe it can be recycled though.

【在 i********e 的大作中提到】
: 请问上面的高人,dynamic light scattering 可行吗?以前做过一点,原理不懂。但
: 材料可以回收,就是用量比较大,而且要纯化蛋白。
: 请哪位能给科普一下?

i********e
发帖数: 50
19

of
非常感谢!请问DLS跟CD是一回事吗?我有未知的纯化样品和已知tetramer的纯化样品
,以前跟老板提过用DLS来做,结果被否决了。他说CD didn't work.我对光学原理真是
一窍不通。DLS是CD?

【在 m**z 的大作中提到】
: yes. you need purified proteins for that. it basically gives you the info of
: the size of the particle. you don't need a lot, maybe 10uM of several
: hundred ul. I believe it can be recycled though.

m**z
发帖数: 787
20
totally different. CD stands for circular dichroism. It is used to monitor
the secondary structure of a protein. I suggest in your case, try gel
filtration chromatography first. Or native gel. These are probably the
easiest to do.

【在 i********e 的大作中提到】
:
: of
: 非常感谢!请问DLS跟CD是一回事吗?我有未知的纯化样品和已知tetramer的纯化样品
: ,以前跟老板提过用DLS来做,结果被否决了。他说CD didn't work.我对光学原理真是
: 一窍不通。DLS是CD?

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i********e
发帖数: 50
21
thank you very much!
看来还是得先解决native page。问题又转回来了。
m**z
发帖数: 787
22
Gel filtration also worth a try. It may be easier if you have the right
column and can separate the monomer/tetramer.

【在 i********e 的大作中提到】
: thank you very much!
: 看来还是得先解决native page。问题又转回来了。

a****k
发帖数: 1130
23
就是说,你拿自己的sample run一个gel filtration column,collect每一个faction,然后用这些fraction做western blot (注:这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根本就不重要,你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面)。gel filtration的每个fraction根据和standard蛋白位置的比较,是可以知道大概的size的,那不就知道你的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda,到时候不就知道是monomer还是tetramer了吗

gel

【在 i********e 的大作中提到】
: thank you very much!
: 看来还是得先解决native page。问题又转回来了。

i********e
发帖数: 50
24

faction,然后用这些fraction做western blot (注:这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根
本就不重要,你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面)。gel filtration的每
个fraction根据和standard蛋白位置的比较,是可以知道大概的size的,那不就知道你
的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda,到时候不就知道是monomer还是
tetramer了吗
我们的tetramer就是用gel filtration 分离纯化出来的,western 的结果也没问题。
现在怀疑monomer的存在。SDS-PAGE的话,假如原本是tetramer的蛋白也会变性成
monomer跑出来。这样就不知道原来fraction里的究竟是tetramer还是mononer.这就是
我为什么想用native-page的原因。monomer就有550Kda,一般gel filtration用的
standard 蛋白没有那么大的。最理想的结果是tetrmer在void volume,monomer不是。
用什么柱子能使2者的re

【在 a****k 的大作中提到】
: 就是说,你拿自己的sample run一个gel filtration column,collect每一个faction,然后用这些fraction做western blot (注:这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根本就不重要,你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面)。gel filtration的每个fraction根据和standard蛋白位置的比较,是可以知道大概的size的,那不就知道你的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda,到时候不就知道是monomer还是tetramer了吗
:
: gel

a****k
发帖数: 1130
25
superose 6上面650KDa的standard蛋白和void还是有相当的距离的。不知道你当时用的
是什么gel filtration column?还有,load的sample volume,elute的speed也会有影响

【在 i********e 的大作中提到】
:
: faction,然后用这些fraction做western blot (注:这时候SDS-PAGE会让蛋白变性根
: 本就不重要,你只是要确定自己的蛋白是在哪些fraction里面)。gel filtration的每
: 个fraction根据和standard蛋白位置的比较,是可以知道大概的size的,那不就知道你
: 的protein的size了吗。你已知monomer是550Kda,到时候不就知道是monomer还是
: tetramer了吗
: 我们的tetramer就是用gel filtration 分离纯化出来的,western 的结果也没问题。
: 现在怀疑monomer的存在。SDS-PAGE的话,假如原本是tetramer的蛋白也会变性成
: monomer跑出来。这样就不知道原来fraction里的究竟是tetramer还是mononer.这就是
: 我为什么想用native-page的原因。monomer就有550Kda,一般gel filtration用的

n********k
发帖数: 2818
26
maybe I shall go to ask you to do me a favor on my problem a couple of
months later...

影响

【在 a****k 的大作中提到】
: superose 6上面650KDa的standard蛋白和void还是有相当的距离的。不知道你当时用的
: 是什么gel filtration column?还有,load的sample volume,elute的speed也会有影响

a****k
发帖数: 1130
27
a couple of months later...嗯,随时欢迎,希望帮得上忙

【在 n********k 的大作中提到】
: maybe I shall go to ask you to do me a favor on my problem a couple of
: months later...
:
: 影响

1 (共1页)
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