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Biology版 - 土问:能不能在一个RT里放多个primer?
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ChIP-qPCR control primerqPCR primer efficiency 问题
怎么GENOTYPE HOMOZYGOTE tg MICE请教个QPCR的问题
Re: PCR primer question能用real time RT-PCR来比较同一细胞的不同gene的含量吗?
SYBR real-time PCR误差很大?请推荐好的DNase
limit of detection with RT-qPCR (SYBR or TaqMan)Primer dimers all the time, no products.
请教qPCR cycle 的问题chip 实验困惑,请大拿指教!!!
在线等:问个real -time pcr仪器的使用问题QPCR中primer浓度对ct影响有多大啊
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相关话题的讨论汇总
话题: rt话题: primer话题: qpcr话题: specific话题: primers
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1 (共1页)
w******e
发帖数: 1187
1
想用random primer做tissue RNA的RT,然后用GAPDH specific primers做qPCR as QC;
同时用aptamer specific primers做RT和qPCR。可以在RT这一步把两种primer放在
一个reaction里做吗?有什么可能的问题?
非常感谢!
c*********r
发帖数: 1312
2
同问^_^
c******r
发帖数: 3778
3
这个很简单,仔细想想就明白了。
当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的,所以对各个RNA
的RT efficiency是不一样的,所以以后的qPCR都没意义了。
如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是
polyA会RT,而你的specific primers也可以RT,结果是你的target被polyA和specific
primers分别RT,而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency
是不一样的,所以二者不再可比。
所以只能要么用poly A,要么target和control都用specific primers。
btw,gapdh的做RT是有kit的,买一个就可以了吧?

QC;

【在 w******e 的大作中提到】
: 想用random primer做tissue RNA的RT,然后用GAPDH specific primers做qPCR as QC;
: 同时用aptamer specific primers做RT和qPCR。可以在RT这一步把两种primer放在
: 一个reaction里做吗?有什么可能的问题?
: 非常感谢!

h********n
发帖数: 4079
4
你是否在实验上验证过你说的"random primer不能用来做qPCR"?

RNA
specific
efficiency

【在 c******r 的大作中提到】
: 这个很简单,仔细想想就明白了。
: 当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的,所以对各个RNA
: 的RT efficiency是不一样的,所以以后的qPCR都没意义了。
: 如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是
: polyA会RT,而你的specific primers也可以RT,结果是你的target被polyA和specific
: primers分别RT,而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency
: 是不一样的,所以二者不再可比。
: 所以只能要么用poly A,要么target和control都用specific primers。
: btw,gapdh的做RT是有kit的,买一个就可以了吧?
:

c******r
发帖数: 3778
5
一针见血,确实没有。。。
不过我也懒得去验证这个,浪费时间啊。
因为验证结果很难generalize,而且需要很多的controls。即使这样,这一次好用,不
一定下一次换了primer仍然好用,仍然要花大量时间去validate,不值得啊。
还不如直接specific primers,一次搞定。

【在 h********n 的大作中提到】
: 你是否在实验上验证过你说的"random primer不能用来做qPCR"?
:
: RNA
: specific
: efficiency

a****o
发帖数: 1786
6
我验证过
扩增效率太低,或者说斜率低,不建议使用

【在 h********n 的大作中提到】
: 你是否在实验上验证过你说的"random primer不能用来做qPCR"?
:
: RNA
: specific
: efficiency

a****o
发帖数: 1786
7
No problem of multiple primers during reverse transcription step. in qPCR,
one primer pair unless it is radioactive labeled, resolved on gel later.

QC;

【在 w******e 的大作中提到】
: 想用random primer做tissue RNA的RT,然后用GAPDH specific primers做qPCR as QC;
: 同时用aptamer specific primers做RT和qPCR。可以在RT这一步把两种primer放在
: 一个reaction里做吗?有什么可能的问题?
: 非常感谢!

c******r
发帖数: 3778
8
是,实际上target specific的primer可以run两三对都没问题。
qPCR为啥不能用multiple target specific primers?只要label不同颜色就可以啊?
SYBR当然是不行的,但是TaqMan是可以的哈

【在 a****o 的大作中提到】
: No problem of multiple primers during reverse transcription step. in qPCR,
: one primer pair unless it is radioactive labeled, resolved on gel later.
:
: QC;

h********n
发帖数: 4079
9
比如你测某几个gene, 用random primer和poly-T primer然后qPCR得到的结果不一样(
against housekeeping gene)?
能不能详细说说?

【在 a****o 的大作中提到】
: 我验证过
: 扩增效率太低,或者说斜率低,不建议使用

c*********r
发帖数: 1312
10
那如果只是做用cDNA做半定量的PCR,然后跑胶看基因表达还是不表达,最多粗略估计
一下表达量高还是低,能把两对引物放一起吗?
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请教qPCR cycle 的问题qPCR primer efficiency 问题
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h****g
发帖数: 439
11
我现在都是用random primer做RT,然后做QPCR,内参挺准的啊
难道我所有的结果都不可信?
c******r
发帖数: 3778
12
两对specific的primers,三对都可能可以。
不行的是random,poly-A,specific的primer混用。我确实没这么干过,只是觉得有问
题,所以没啥实际经验。

【在 c*********r 的大作中提到】
: 那如果只是做用cDNA做半定量的PCR,然后跑胶看基因表达还是不表达,最多粗略估计
: 一下表达量高还是低,能把两对引物放一起吗?

p******d
发帖数: 3737
13
这个真的弄糊涂我了,我同意你说random primer对各个RNA的efficiency是不一样的,
可是能保
证GOI和house keeping gene的specific primer就有同样的efficiency吗?序列不同,
efficiency不一样很正常啊,只要是比较的是同样条件下实验组和对照组的差别就可以
了吧?就算
random primer对GOI和house keeping gene的效率不同,最后要比较的还是实验组和对
照组的相
对差别啊。

RNA
specific
efficiency

【在 c******r 的大作中提到】
: 这个很简单,仔细想想就明白了。
: 当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的,所以对各个RNA
: 的RT efficiency是不一样的,所以以后的qPCR都没意义了。
: 如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是
: polyA会RT,而你的specific primers也可以RT,结果是你的target被polyA和specific
: primers分别RT,而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency
: 是不一样的,所以二者不再可比。
: 所以只能要么用poly A,要么target和control都用specific primers。
: btw,gapdh的做RT是有kit的,买一个就可以了吧?
:

m**********2
发帖数: 6568
14
我做过8个基因的。用基因specific reverse primers RT,稍微上游一点,一对儿一对
儿的做
real time qPCR。效果不错。

【在 c******r 的大作中提到】
: 是,实际上target specific的primer可以run两三对都没问题。
: qPCR为啥不能用multiple target specific primers?只要label不同颜色就可以啊?
: SYBR当然是不行的,但是TaqMan是可以的哈

f*********r
发帖数: 1233
15
当然可信。前提是,做逆转录的时候,模板mRNA一定不要过量。甚至可以有意识地少放
一点。这样的话,RT之后,基本可以保证所有模板都被逆转录,形成相等量dscDNA。要
的就是这种完全没有特异性的1:1的RT。
那一个样品做上n次,就可以看出,每次RT的效果是恒定的。

【在 h****g 的大作中提到】
: 我现在都是用random primer做RT,然后做QPCR,内参挺准的啊
: 难道我所有的结果都不可信?

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