j***i
发帖数: 39 | 1 做一个EKR1/2底物磷酸化的实验，用ERK1/2抑制剂发现磷酸化被block掉.
但是32-ATP体外磷酸化做了两次，都没信号。
磷酸化实验没问题，因为positive control可以被phos-ERK2磷酸化。
有没有可能ERK不是上游直接Kinase?
不知道那位有好的idea? |
h**********y
发帖数: 18 | 2 我做过一个实验，不是MAPK，用的是MAP2K，
发现在in vitro kinase的条件下，MAP2K自己就可以autophosphorylation，我猜想
MAPK应该也会是类似的情况，毕竟体外的实验总是有一些artifact。另外，看早期的
MAPK的paper，他们的in vitro kinase assay是不需要加入MAP2K的。当然加入MAP2K之
后，对MAPK底物的磷酸化会强很多。
另外，你在你的kinase里面有没有加入DTT？我们发现某些kinase因为某些特定位置的
aa，对DTT是敏感的。而ERK在相应的位置恰好存在一个这样的aa
【在 j***i 的大作中提到】
: 做一个EKR1/2底物磷酸化的实验，用ERK1/2抑制剂发现磷酸化被block掉.
: 但是32-ATP体外磷酸化做了两次，都没信号。
: 磷酸化实验没问题，因为positive control可以被phos-ERK2磷酸化。
: 有没有可能ERK不是上游直接Kinase?
: 不知道那位有好的idea?
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j***i
发帖数: 39 | 3 谢谢hanchenjammy的分享。
1）我用了1mM DTT在Kinase Buffer。这次我去掉DTT试试；
2）“当然加入MAP2K之后，对MAPK底物的磷酸化会强很多” EK293T中才纯化的ERK2,收
细胞前，用EGF刺激细胞，让EKR磷酸化，所以可以替代加MAP2K；
3）我发现分子量很小的一个位置（20Kd?），有信号，而对照点突变没有，可能是降解
产物。所以在想：是不是全长不容易被磷酸化？降解的反而暴露出位点？
有没有新的结果，给告详解。 |
j***i
发帖数: 39 | 4 update my result.
其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
再次感谢hanchenjammy 。 |
s*********s
发帖数: 110 | 5 good~
【在 j***i 的大作中提到】
: update my result.
: 其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
: 可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
: 再次感谢hanchenjammy 。
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h**********y
发帖数: 18 | 6 cong~~
【在 j***i 的大作中提到】
: update my result.
: 其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
: 可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
: 再次感谢hanchenjammy 。
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