b*********l
发帖数: 490 | 1 Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
Thanks a lot. |
w******a
发帖数: 1527 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 3 这种kit太多了吧
现在几乎每个生产试剂盒的公司都有
被广泛使用的一个是qiagen的RNAeasy
还有就是Ambion的kit了
不过要看你材料是什么
有的东西其实还是phenol chloriform的效果好
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
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h********n
发帖数: 4079 | 4 I use miRNeasy from qiagen.
Please notice that RNeasy will not yield miRNA or other small RNA.
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
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c*********r
发帖数: 1312 | 5 Qiagen的很好用，一直在用。最近看到Fermentas的新kit，在降价做活动，几乎是
Qiagen的一半价格。准备用完了Qiagen的买个fermentas的试一试。 |
m**z
发帖数: 787 | 6 我们实验室的DNA相关的都换成fermentas的了，work得很好啊，据说便宜不少，里面的
东西其实是一样的，连buffer都可以通用。。。RNA的kit不知道怎么样
【在 c*********r 的大作中提到】
: Qiagen的很好用，一直在用。最近看到Fermentas的新kit，在降价做活动，几乎是
: Qiagen的一半价格。准备用完了Qiagen的买个fermentas的试一试。
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C*******e
发帖数: 4348 | 7 要看lz要做什么了
现在差不多每个出RNA kit的公司也都有专提或者enrich mRNA，small RNA的kit
【在 h********n 的大作中提到】
: I use miRNeasy from qiagen.
: Please notice that RNeasy will not yield miRNA or other small RNA.
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c*********r
发帖数: 1312 | 8 我们的内切酶都换成他家的了，趁着上一波买一赠一的时候换的，用着也不错。和他们
的客服交流说，他们的很多DNA，RNA kit目标是冲着Qiagen去的。希望能做出和Qiagen
一样质量但便宜很多的kit。
估计他们没有两把刷子也不会被Thermo-Fisher收购。
【在 m**z 的大作中提到】
: 我们实验室的DNA相关的都换成fermentas的了，work得很好啊，据说便宜不少，里面的
: 东西其实是一样的，连buffer都可以通用。。。RNA的kit不知道怎么样
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b*********l
发帖数: 490 | 9 其实就是提取斑马鱼组织totalRNA而已，没有花头。我是觉得qiagen应该有这种kit,不
知道怎么没找到，哈哈，真土。那我要不就试试fermenta的，以前也用过他们的酶，效
果不错。谢谢大家啊，节日快乐。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 这种kit太多了吧
: 现在几乎每个生产试剂盒的公司都有
: 被广泛使用的一个是qiagen的RNAeasy
: 还有就是Ambion的kit了
: 不过要看你材料是什么
: 有的东西其实还是phenol chloriform的效果好
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 记下了～
回头看看
Qiagen
【在 c*********r 的大作中提到】
: 我们的内切酶都换成他家的了，趁着上一波买一赠一的时候换的，用着也不错。和他们
: 的客服交流说，他们的很多DNA，RNA kit目标是冲着Qiagen去的。希望能做出和Qiagen
: 一样质量但便宜很多的kit。
: 估计他们没有两把刷子也不会被Thermo-Fisher收购。
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a********k
发帖数: 2273 | 11 Qiagen RNeasy就很好用，如果是全鱼的话用他的fibrous tissue的kit更好
【在 b*********l 的大作中提到】
: 其实就是提取斑马鱼组织totalRNA而已，没有花头。我是觉得qiagen应该有这种kit,不
: 知道怎么没找到，哈哈，真土。那我要不就试试fermenta的，以前也用过他们的酶，效
: 果不错。谢谢大家啊，节日快乐。
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b*********l
发帖数: 490 | 12 我也记下了，谢谢。
【在 a********k 的大作中提到】
: Qiagen RNeasy就很好用，如果是全鱼的话用他的fibrous tissue的kit更好
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c*********r
发帖数: 1312 | 13 忘了说了，我说他家kit便宜是指年底之前用那个promo code之后的价格，链接在这里。
http://order.fermentas.com/USA/WebMedia/US_NPS_Supplement_2010.pdf
在这里说一下免得有人多花了钱。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 记下了～
: 回头看看
:
: Qiagen
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w******a
发帖数: 1527 | 14 谢谢分享啊~~~~
里。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 忘了说了，我说他家kit便宜是指年底之前用那个promo code之后的价格，链接在这里。
: http://order.fermentas.com/USA/WebMedia/US_NPS_Supplement_2010.pdf
: 在这里说一下免得有人多花了钱。。。
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w******a
发帖数: 1527 | 15 借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？ |
M*****n
发帖数: 16729 | 16 Qiagen
trizol is a cheap substitute |
k*****n
发帖数: 9823 | 17 qiagen miRNeasy带Qiazol（就是Trizol）
【在 w******a 的大作中提到】
: 借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？
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s********l
发帖数: 1195 | 18 we use Ambion kit on a constant base, pretty reliable.
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
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C*******e
发帖数: 4348 | 19 有的东西用kit做效果不好
结果还是要用trizol
trizol其实也就是加了别的东西的phenol
【在 w******a 的大作中提到】
: 借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？
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w******a
发帖数: 1527 | 20 I don't know... our lab has the protocol that we should use TRIZOL first and
then use Qiagen kit... I think this is weird but nobody tells me why... but
the output is very good.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有的东西用kit做效果不好
: 结果还是要用trizol
: trizol其实也就是加了别的东西的phenol
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C*******e
发帖数: 4348 | 21 能不能分享一下你们实验室的protocol？
and
but
【在 w******a 的大作中提到】
: I don't know... our lab has the protocol that we should use TRIZOL first and
: then use Qiagen kit... I think this is weird but nobody tells me why... but
: the output is very good.
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w******a
发帖数: 1527 | 22 I don't think it is good, coz it takes me 2 hours to get the RNA...
【在 C*******e 的大作中提到】
: 能不能分享一下你们实验室的protocol？
:
: and
: but
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w******a
发帖数: 1527 | 23 Check this one:
Reagents
* TRIzol from Invitrogen #15596-108.
* Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
* Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
* Keep TRIzol at 4C.
* Use RNase-free tubes and tips for all steps.
* Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
1. Add 1.2 ml TRIzol reagent to cells/tissues (5~10X 106 cells/ml or 50~100
mg tissue).
2. Homogenize till no debris present. For cells, lyse by pipetting. Then
keep on ice.
3. Pre-centrifuge the Phase Lock Gel at 14K RPM for 3 min at RT.
4. Use sterile RNase-free tips and transfer 1 ml solution to each phase lock
gel tube. add 0.2 ml chloroform. Shake it by hand to make sure the organic
solution mixes well with RNA. Rotate at 4C for 20 min.
Note: Alternatively, you can transfer 1 ml solution into a RNase-free tube,
add 200 ul chloroform and then proceed for following steps.
5. Spin down at 14K RPM for 15 min at 4C.
6. Transfer the aqueous phase (60% of initial TRIzol), ~600 ul to a gDNA
elimination column.
Note: This step should be very easy since the lower and upper phases are
separated by PLG.
7. Spin down at 14K RPM for 1 min at RT.
8. Remove the column and keep the flowthrough in the collection tube.
9. Add 600 ul cold 70% ethanol (always store at -20C) to the collection tube.
10. Pipette up and down several times to mix the solution.
11. Apply up to 700 ul of the sample to RNeasy mini column, spin down, 14K
RPM for 1 min, discard the flowthrough, and apply again to load all the
samples.
12. Add 700 ul buffer RW1 to the column, centrifuge for 1 min at 14K RPM and
discard the flowthrough.
13. Wash the column with 500 ul RPE，2 times. Spin down to remove
flowthrough at 14K RPM for 1 min. Discard the flowthrough.
14. Spin down to remove any carryover of RPE by centrifugation with empty
collection tubes at 14K RPM for 1 min at RT.
15. Transfer the column to a new RNase-free tube, and add 30 - 50 ul RNase-
free water (provided in the kit) to the center of the column. Leave on bench
for 1 min, and then spin down at 14K RPM for 1 min at RT.
16. Measure RNA OD260, OD280 and concentration by nanodrop or regular
spectrophotometer.
17. I usually store the RNA at -20C or immediately proceed for RT-PCR.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 能不能分享一下你们实验室的protocol？
:
: and
: but
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C*******e
发帖数: 4348 | 24 谢谢！
记下了
我现在用的方法就是kit也要两小时
光用trizol应该产量大一些
我的实验对产量要求比较高
【在 w******a 的大作中提到】
: Check this one:
: Reagents
: * TRIzol from Invitrogen #15596-108.
: * Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
: * Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
: * Keep TRIzol at 4C.
: * Use RNase-free tubes and tips for all steps.
: * Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
: RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
: the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
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w******a
发帖数: 1527 | 25 我觉得Transfer the aqueous phase最重要，要尽可能多的把aqueous phase全都吸出
来。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢！
: 记下了
: 我现在用的方法就是kit也要两小时
: 光用trizol应该产量大一些
: 我的实验对产量要求比较高
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 呵呵
我觉得比较重要的是第一步trizol
（或者别的phenol based reagent不管每个公司起的什么名字）
和起始材料之间的比例比较重要
另外我自己做过对比
phenol based方法不走colum比走column产量多出来至少5倍以上
对于起始材料足够多，或者下游实验对于产量没有太大要求的实验来说自然column方便
省事
不过有时候还是需要用old fashioned method啊
【在 w******a 的大作中提到】
: 我觉得Transfer the aqueous phase最重要，要尽可能多的把aqueous phase全都吸出
: 来。
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w******a
发帖数: 1527 | 27 哦，我加多少trizol都是严格按照说明书来的，倒是没有比较过。。。
不走column我就怕有污染。。。
我有时候担心吸到aqueous phase下面的白白的东西，所以就宁愿浪费一点aqueous
phase,但是如果换个小号的tips，就会吸得干净些，产量也会高些。
I'm not sure if I'm being clear enough :)
【在 C*******e 的大作中提到】
: 呵呵
: 我觉得比较重要的是第一步trizol
: （或者别的phenol based reagent不管每个公司起的什么名字）
: 和起始材料之间的比例比较重要
: 另外我自己做过对比
: phenol based方法不走colum比走column产量多出来至少5倍以上
: 对于起始材料足够多，或者下游实验对于产量没有太大要求的实验来说自然column方便
: 省事
: 不过有时候还是需要用old fashioned method啊
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