d**********2
发帖数: 103 | 1 大虾们好。。。
小弟最近在转染293T来筛选能激活CASPASE3 的蛋白。。。
先是用了promega 的Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay来检测caspase 3
激活。。。
但是负对照和staurosporin 处理的细胞没有区别。。。
转而用santa cruz 的caspase 3 抗体（caspase-3 (H-277): sc-7148）检测p17/p19
也未果。。。只能见到全场的
caspase 3 。。。staurosporin 浓度1ug/ml, 5H 。。。都可以看到细胞明显的形态变
化了。。。甚至看到细胞内很多小
泡泡。。 (凋亡小体)？...
迷茫啊。。。各位觉得是抗体/试剂盒/细胞株还是staurosporin有问题呢？请各位不吝
赐教啊。。。。
谢谢～～ |
s******n
发帖数: 63 | 2 这好像是第二次发咯，楼主求建议的时候最好把自己的问题简洁、严肃的描述出来，虽
说是bbs，不是什么学术场合，但是你自己都不严肃，别人又怎么会认真呢？
caspase 3的p17/p19不太好做，可能要多试几种抗体。
promega 的Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay实验组和对照组没区别：
staurosporin的浓度、刺激时间预实验要摸索一下，
caspase-3转染的浓度要低一些，稍微一过量就自激活，细胞就都死了。
另外就是设阳性对照啊，引起caspase-3激活的刺激应该不止staurosporin吧，找个最
稳定的刺激作为阳性对照。 |
s******n
发帖数: 63 | 3 这好像是第二次发咯，楼主求建议的时候最好把自己的问题简洁、严肃的描述出来，虽
说是bbs，不是什么学术场合，但是你自己都不严肃，别人又怎么会认真呢？
caspase 3的p17/p19不太好做，可能要多试几种抗体。
promega 的Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay实验组和对照组没区别：
staurosporin的浓度、刺激时间预实验要摸索一下，
caspase-3转染的浓度要低一些，稍微一过量就自激活，细胞就都死了。
另外就是设阳性对照啊，引起caspase-3激活的刺激应该不止staurosporin吧，找个最
稳定的刺激作为阳性对照。 |
j********r
发帖数: 156 | 4 以前听说过，cleaved capase3/9的检测 using immunoblot 需要用sds sample buffer
to lyse the cells. 如果用other lysis buffer, such as RIPA, there are might
be problems. Not sure if this is true. |
d**********2
发帖数: 103 | 5 Thanks for the information:) And I will try to make things formal:)
To be clear, I was looking at the proteins that could activate the caspase 3
under transfection condition, but not transfecting cells with caspase 3.
Also, I tried different time/conc of STS treatment...did not work...i could
alway only see the full length caspase 3. So if you dont mind can you tell
me what antibody you use? Like company and catalog num? Thanks alot and I
appreciate it:) |
s******n
发帖数: 63 | 6 呵呵，我没做过caspase-3，我做过caspase-1, 只是听一个师兄说，caspase家族的WB
都不太好做.Biovision有没有caspase-3抗体啊？他们家在caspase这方面做得不错，产
品也比较全。 |
d**********2
发帖数: 103 | 7 hehe 谢谢 stubborn 这个小实验貌似是不那么容易。。。不过你介意分享一下你们怎
么detect activated casp3 的protocol 么。。。谢谢啊～～ |
