k****o
发帖数: 589 | 1 我知道前者常用来研究蛋白半衰期，后者则用来抑制转录以便研究mRNA稳定性。不知道
这两个抑制剂的
off-target effect多不多（使用文献中的浓度）？还有它们是否会引发细胞凋亡？
另外，我不清楚如果抑制了蛋白合成，蛋白的降解会不会因此也受到影响？类似地，如
果抑制了转录，
mRNA的稳定性可能受到间接影响吗？如果有文章探讨这方面的问题请给个链接，谢谢！
！ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 如果处理时间过长，两者都会引发细胞调亡。
一般不宜超过8个小时。
抑制蛋白合成之后，是有可能间接的使得某些蛋白的降解受到影响。所以一般不能
仅仅用cycloheximide 的数据来说明问题，而是必须有其他辅佐手段来佐证。
比方说用pulse labeling, or MG132 treatment
【在 k****o 的大作中提到】
: 我知道前者常用来研究蛋白半衰期，后者则用来抑制转录以便研究mRNA稳定性。不知道
: 这两个抑制剂的
: off-target effect多不多（使用文献中的浓度）？还有它们是否会引发细胞凋亡？
: 另外，我不清楚如果抑制了蛋白合成，蛋白的降解会不会因此也受到影响？类似地，如
: 果抑制了转录，
: mRNA的稳定性可能受到间接影响吗？如果有文章探讨这方面的问题请给个链接，谢谢！
: ！
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k****o
发帖数: 589 | 3
谢谢sunny！看来它们的细胞毒性和我估计的近似。不过还有些疑问想和你探讨一下：
1. 这两种抑制剂应该不适合研究半衰期长的蛋白和mRNA吧？有没有毒性较小的替代抑
制剂？
2. MG132是proteosome抑制剂，为什么可以用它来支持cycloheximide的数据？
3. 研究蛋白和mRNA半衰期，除开放射性元素的pulse-chase，还有没有什么不用同位素
的办法？
多谢指教！
【在 s******y 的大作中提到】
: 如果处理时间过长，两者都会引发细胞调亡。
: 一般不宜超过8个小时。
: 抑制蛋白合成之后，是有可能间接的使得某些蛋白的降解受到影响。所以一般不能
: 仅仅用cycloheximide 的数据来说明问题，而是必须有其他辅佐手段来佐证。
: 比方说用pulse labeling, or MG132 treatment
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b******e
发帖数: 3348 | |
s******y
发帖数: 28562 | 5
抑制剂？
这两个已经几乎是最好使的了。要研究半衰期特别长的话就只能上同位素了
有人已经说了，就跟下水道塞子和龙头的关系一样。如果一个蛋白降解得快的话，
用MG132会导致它出现积累，相对于不降解的蛋白就会有比较大比例的升高。
当然，你不能同时加cycloheximide，否则就成了左脚踩刹车右脚踩油门了
还可以用其他方法标志的氨基酸或者核酸。比方说我记得某个公司（either promega
or Ambion) 有卖用biotin 或者荧光标记的amino acid/Nulceotide kit, 似乎可以用
来做pulse-chase
【在 k****o 的大作中提到】
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: 谢谢sunny！看来它们的细胞毒性和我估计的近似。不过还有些疑问想和你探讨一下：
: 1. 这两种抑制剂应该不适合研究半衰期长的蛋白和mRNA吧？有没有毒性较小的替代抑
: 制剂？
: 2. MG132是proteosome抑制剂，为什么可以用它来支持cycloheximide的数据？
: 3. 研究蛋白和mRNA半衰期，除开放射性元素的pulse-chase，还有没有什么不用同位素
: 的办法？
: 多谢指教！
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b******e
发帖数: 3348 | 6 借这个题目问sunny一个问题，
我研究一个药物对某蛋白的作用，已知此药物能都抑制蛋白在细胞内的accumulation，
并且知道该药物对蛋白的mRNAlevel没有作用，
因此想搞清楚该药物对蛋白是抑制protein合成还是促进protein降解.
我做了一个实验，发现使用mg132抑制蛋白降解以后，该药物依然能够阻止蛋白在细胞
内的积累。然后我就倾向认为该药物抑制了蛋白的合成，而不是降解。
但是我导师说mg132只是抑制部分proteasomes,而不是全部，而且protein degradation
不完全靠proteasome (我这方面不是很确定），所以可能该药物能够促进蛋白降解，不
过不是通过proteasome.感觉好像也有道理。
sunny能普及一下mg132的作用和protein degradation吗
【在 s******y 的大作中提到】
:
: 抑制剂？
: 这两个已经几乎是最好使的了。要研究半衰期特别长的话就只能上同位素了
: 有人已经说了，就跟下水道塞子和龙头的关系一样。如果一个蛋白降解得快的话，
: 用MG132会导致它出现积累，相对于不降解的蛋白就会有比较大比例的升高。
: 当然，你不能同时加cycloheximide，否则就成了左脚踩刹车右脚踩油门了
: 还可以用其他方法标志的氨基酸或者核酸。比方说我记得某个公司（either promega
: or Ambion) 有卖用biotin 或者荧光标记的amino acid/Nulceotide kit, 似乎可以用
: 来做pulse-chase
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s******y
发帖数: 28562 | 7 蛋白降解一般而言可以至少有两个途径：proteasome, lysosome, 再加上limited
proteolysis by calpain or other proteases.
前者可以用MG132 or beta-lactone
中间可以用100mM NH4Cl
后者可以用calpain inhibitors
MG132 本身是一个小多肽模拟物，一般认为是堵塞chymotrypsin-like cleavage
activity. 所以其实也不是一个很干净的inhibitor, cross-react with calpain and
other protease. 但是它在浓度比较高的时候(20uM) 对proteasome 抑制
是非常明显的。
beta-lactone 主要通过和proteasome subunit crosslinking 而起作用，比
MG132 专一性稍微好一点点，但是抑制作用不是特别明显。
不管哪个inhibitor 都不能完全解决问题。我不能说你的导师到底是对还是错，
但是你应该找其他方法来佐证。比方说，你可以看看蛋白用这个东西处理的时候，
降解曲线有没有变化。
degradation
【在 b******e 的大作中提到】
: 借这个题目问sunny一个问题，
: 我研究一个药物对某蛋白的作用，已知此药物能都抑制蛋白在细胞内的accumulation，
: 并且知道该药物对蛋白的mRNAlevel没有作用，
: 因此想搞清楚该药物对蛋白是抑制protein合成还是促进protein降解.
: 我做了一个实验，发现使用mg132抑制蛋白降解以后，该药物依然能够阻止蛋白在细胞
: 内的积累。然后我就倾向认为该药物抑制了蛋白的合成，而不是降解。
: 但是我导师说mg132只是抑制部分proteasomes,而不是全部，而且protein degradation
: 不完全靠proteasome (我这方面不是很确定），所以可能该药物能够促进蛋白降解，不
: 过不是通过proteasome.感觉好像也有道理。
: sunny能普及一下mg132的作用和protein degradation吗
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b******e
发帖数: 3348 | 8 非常感谢，正想作degradation曲线
我接下来想做的一个实验是先诱导蛋白合成到一定量（达到westernblot可测的量）然
后用chx抑制（相当于关水龙头），再加药物，然后测几个时间
如果药物对chx treated samples没有明显作用，就证明不是degradation,而是protein
synthesis.
不过觉得如果chx不能彻底抑制蛋白合成，药物作用如果也是抑制蛋白合成，可能会造
成和chx treatment的作用叠加，结果不明朗。
and
【在 s******y 的大作中提到】
: 蛋白降解一般而言可以至少有两个途径：proteasome, lysosome, 再加上limited
: proteolysis by calpain or other proteases.
: 前者可以用MG132 or beta-lactone
: 中间可以用100mM NH4Cl
: 后者可以用calpain inhibitors
: MG132 本身是一个小多肽模拟物，一般认为是堵塞chymotrypsin-like cleavage
: activity. 所以其实也不是一个很干净的inhibitor, cross-react with calpain and
: other protease. 但是它在浓度比较高的时候(20uM) 对proteasome 抑制
: 是非常明显的。
: beta-lactone 主要通过和proteasome subunit crosslinking 而起作用，比
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h*****4
发帖数: 36 | 9 师姐我来给你补充一下，
autophagy也是一个比较常见的降解通路，虽然最终经过lysosome降解蛋白质，但它不
等同于经典的lysosome降解(NH4Cl抑制的那种)。
常见的能block autophagy降解通路的药物有：3-MA, Bafilomycin A1 等等 还有能促
进的如Rapamycin等 可查阅相关文献。实际上autophagy最近这些年一直做得比较火热
。嘿嘿~
and
【在 s******y 的大作中提到】
: 蛋白降解一般而言可以至少有两个途径：proteasome, lysosome, 再加上limited
: proteolysis by calpain or other proteases.
: 前者可以用MG132 or beta-lactone
: 中间可以用100mM NH4Cl
: 后者可以用calpain inhibitors
: MG132 本身是一个小多肽模拟物，一般认为是堵塞chymotrypsin-like cleavage
: activity. 所以其实也不是一个很干净的inhibitor, cross-react with calpain and
: other protease. 但是它在浓度比较高的时候(20uM) 对proteasome 抑制
: 是非常明显的。
: beta-lactone 主要通过和proteasome subunit crosslinking 而起作用，比
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p*****m
发帖数: 7030 | 10 同志们 sunnyday同学的性别问题该明确了吧 哈哈
【在 h*****4 的大作中提到】
: 师姐我来给你补充一下，
: autophagy也是一个比较常见的降解通路，虽然最终经过lysosome降解蛋白质，但它不
: 等同于经典的lysosome降解(NH4Cl抑制的那种)。
: 常见的能block autophagy降解通路的药物有：3-MA, Bafilomycin A1 等等 还有能促
: 进的如Rapamycin等 可查阅相关文献。实际上autophagy最近这些年一直做得比较火热
: 。嘿嘿~
:
: and
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j****x
发帖数: 1704 | 11 没pp没真相啊
【在 p*****m 的大作中提到】
: 同志们 sunnyday同学的性别问题该明确了吧 哈哈
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g*********5
发帖数: 2533 | |
h*****4
发帖数: 36 | 13 ...啊呀呀
貌似我不小心走漏了什么风声吗 呜呜呜呜@.@
【在 p*****m 的大作中提到】
: 同志们 sunnyday同学的性别问题该明确了吧 哈哈
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