H*********8
发帖数: 323 | 1 用某个 基因 的启动子驱动cre ，用 的 是bac载体，转进一个报告 基因中，如果cre
work，报告 基因就转换颜色。用电穿
孔转这个bac，有对照组，用的商业性 的pgk启动子驱动cre，几乎80％以上 细胞颜色
转 过来 了。但bac里 转的 没有，这
个bac智力绝对没 问题。我怀疑电穿孔转bac效率太低，但用15kb的智力试电穿孔 的
效率能 达到25％多。我的 bac大概
250kb，大家 有 什么 好的 方法。做了1－2个月了，很郁闷。请赐教。 | H****s
发帖数: 301 | 2 如果你确定你的BAC质粒和电转参数没有问题的话，买商业化的电转感受态细胞（DH10B
之类的）。我当时做一个220kb的BAC质粒，一直转不进去（用的是自己做的感受态）。
买了商用电转感受态细胞后，一次就转进去了。
cre
【在 H*********8 的大作中提到】
: 用某个 基因 的启动子驱动cre ，用 的 是bac载体，转进一个报告 基因中，如果cre
: work，报告 基因就转换颜色。用电穿
: 孔转这个bac，有对照组，用的商业性 的pgk启动子驱动cre，几乎80％以上 细胞颜色
: 转 过来 了。但bac里 转的 没有，这
: 个bac智力绝对没 问题。我怀疑电穿孔转bac效率太低，但用15kb的智力试电穿孔 的
: 效率能 达到25％多。我的 bac大概
: 250kb，大家 有 什么 好的 方法。做了1－2个月了，很郁闷。请赐教。
| V**F
发帖数: 164 | 3 do you know whether the promoter of your gene is activated in the target
cells?
are you trying to make stable lines?
cre
【在 H*********8 的大作中提到】
: 用某个 基因 的启动子驱动cre ，用 的 是bac载体，转进一个报告 基因中，如果cre
: work，报告 基因就转换颜色。用电穿
: 孔转这个bac，有对照组，用的商业性 的pgk启动子驱动cre，几乎80％以上 细胞颜色
: 转 过来 了。但bac里 转的 没有，这
: 个bac智力绝对没 问题。我怀疑电穿孔转bac效率太低，但用15kb的智力试电穿孔 的
: 效率能 达到25％多。我的 bac大概
: 250kb，大家 有 什么 好的 方法。做了1－2个月了，很郁闷。请赐教。
| s******s
发帖数: 13035 | 4 你是转细菌还是mammalian cell啊？转细菌我没做过，转cell culture我们
实验室用lipofectmin ltx
cre
【在 H*********8 的大作中提到】
: 用某个 基因 的启动子驱动cre ，用 的 是bac载体，转进一个报告 基因中，如果cre
: work，报告 基因就转换颜色。用电穿
: 孔转这个bac，有对照组，用的商业性 的pgk启动子驱动cre，几乎80％以上 细胞颜色
: 转 过来 了。但bac里 转的 没有，这
: 个bac智力绝对没 问题。我怀疑电穿孔转bac效率太低，但用15kb的智力试电穿孔 的
: 效率能 达到25％多。我的 bac大概
: 250kb，大家 有 什么 好的 方法。做了1－2个月了，很郁闷。请赐教。
| H*********8
发帖数: 323 | 5 谢谢楼上的回答, 是转mammalian cell, lipofectmin ltx
试过,转商业性的质粒,在我细胞系里能达到80-90%,但转我的BAC, 不WORK.
do you know whether the promoter of your gene is activated in the target
cells?
这位兄弟问得好,我在做之前就RT-PCR过了,表达.而且在这个细胞系里表达应该不弱,这
是肯定的.
我最终要做转基因老鼠,但做之前我需要确定这个BAC做得没问题,所以先在体外用细胞
系做.
这个BAC的构建方式是这样的,携带着整个A基因的BAC, 在第一个外显子处插入CRE基因,
把本身A基因的ATG突变掉,关键我老板设计的时候,CRE只有STOP CODON, 但没有PLOY A,
然后就这么插进第一个外显子里了. 我不知道算融合蛋白,还是到CRE终止子这儿就停
止翻译呢? 这样设计是否影响CRE的功能?
所以在做转基因老鼠之前,我得看看是不是WORK.
请有经验的人给指导指导. | s******s
发帖数: 13035 | 6 我们一直用ltx转BAC，没有问题。你的是不是BAC设计的问题？
要么你转了以后长一个礼拜，然后抽DNA做下PCR看看是不是有BAC在里面。
因,
A,
【在 H*********8 的大作中提到】
: 谢谢楼上的回答, 是转mammalian cell, lipofectmin ltx
: 试过,转商业性的质粒,在我细胞系里能达到80-90%,但转我的BAC, 不WORK.
: do you know whether the promoter of your gene is activated in the target
: cells?
: 这位兄弟问得好,我在做之前就RT-PCR过了,表达.而且在这个细胞系里表达应该不弱,这
: 是肯定的.
: 我最终要做转基因老鼠,但做之前我需要确定这个BAC做得没问题,所以先在体外用细胞
: 系做.
: 这个BAC的构建方式是这样的,携带着整个A基因的BAC, 在第一个外显子处插入CRE基因,
: 把本身A基因的ATG突变掉,关键我老板设计的时候,CRE只有STOP CODON, 但没有PLOY A,
| e***o
发帖数: 344 | 7 这个lipofectmin ltx转BAC,效率大概有多高? 有5%吗？ | s******s
发帖数: 13035 | 8 说实话，我不知道。因为我们没有荧光标记，都是用drug选的
【在 e***o 的大作中提到】
: 这个lipofectmin ltx转BAC,效率大概有多高? 有5%吗？
| e***o
发帖数: 344 | |
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