x**e
发帖数: 163 | 1 用的是BIO-RAD的CFX-96 的机器，每个样品做3个技术重复，居然在3个技术重复里面Ct
值有2-3的差异。技术重复都是配成mixture然后pipet到3个well里面的，照理应该是绝
对一样的啊，分装的时候操作也很小心。
用的SYBR green是以前order的ROCHE公司的，在BIO-RAD的机器上做应该没有问题吧？
样品很珍贵，试了几次都快用光了，大家觉得有哪些可能原因？先谢了。 |
h********n
发帖数: 4079 | |
Z******5
发帖数: 435 | |
x**e
发帖数: 163 | 4 对照用的是Ubiqutin，Ct值的3个重复分别是23，25，29，误差太大了，我的target基
因的Ct也大概是在23-30之间。我刚刚搜了一下，说模板浓度太低会影响重复性，但如
果Ct在23或者25左右应该不算太低吧。
机器是2个月前才买的新机器，应该不会有受热不均的问题吧？ |
x**e
发帖数: 163 | 5 以前很少做real-time，机器要如何校正啊？ |
r******a
发帖数: 285 | 6 板子封好了吗？上机前有没有离心？
Ct
【在 x**e 的大作中提到】
: 用的是BIO-RAD的CFX-96 的机器，每个样品做3个技术重复，居然在3个技术重复里面Ct
: 值有2-3的差异。技术重复都是配成mixture然后pipet到3个well里面的，照理应该是绝
: 对一样的啊，分装的时候操作也很小心。
: 用的SYBR green是以前order的ROCHE公司的，在BIO-RAD的机器上做应该没有问题吧？
: 样品很珍贵，试了几次都快用光了，大家觉得有哪些可能原因？先谢了。
|
x**e
发帖数: 163 | 7 板子应该封好了，做完以后看well里面的产物体积没有明显的变化。倒是没有离心，但
我加的时候都是直接加到管底，也留意了没有东西挂在管壁上。 |
A******y
发帖数: 2041 | 8 I hope you have checked your primer linearity at least. I don't think Biorad CFX-96 needs adjustment. Its optic is based on the chrome4 fiber-optic module. |
t*****z
发帖数: 1598 | 9 如果有条件的话离下心吧，赶掉小气泡，样品少的话，就不要用板上最边缘那一圈，它
们容易漏气。 |
v***2
发帖数: 131 | 10 Have you done the melting curves? how many products do you have after the
real time PCR? Have you perform the cDNA gradient dilution to optimize your
template concentration? Have you use ROX as refrence? And where do you fill
your samples? is it in edge?
Biorad real time PCR is not so specific, from my experience, Applied system
is far better. |
|
|
o****e
发帖数: 37 | 11 try Bio-rad's reagent. It will work much better. |
j******n
发帖数: 941 | 12 我用过biorad的iq5 一般机器给的几个孔的std大于0.25都认为是重复性不好。我以前
出过一次类似的问题， 最早最早来这个实验室的时候出现的， 是因为最后加的那个酶
混合物， 做master solution的时候没混合彻底，因为那个是保存在甘油里面的，需要
额外多混合几次，然后加模板也要用pipetor上下混合5次以上
除此之外 我没出过类似的问题
试剂不是影响的关键，这种qPCR机器跟试剂技术早已烂大街了，我在biorad机器上几乎用过大部分公司的产品，一致性都是相当好的。
还有，不排除机器老化后，孔之间的温控不均一，不过这个可以通过调整样品位置来排查。 |
o**4
发帖数: 35028 | |
s**u
发帖数: 9035 | 14 All reagents, buffer need thaw and centrifuge throughly. |
j****x
发帖数: 1704 | 15 这种误差无论在任何机器上使用任何试剂耗材，正常操作下都是不大可能出现的。
1. master mix解冻后要先混匀
2. 有些实验室为了省钱，反应体系只用10ul/well甚至更低。除非你已经很熟练了或者
有机器人，否则不建议这么做。
3. DNA模板用量至少不应低于2ul/well，一般建议4-6ul（必要时应先稀释DNA样本），
这样可以显著减少pipetting error。
4. 加样之后离心是必须步骤，即便留意了加在了管底管壁无明显残留。其实个人感觉
不建议加到管底，这样容易在tip头上粘附残留，带出时还会粘到孔口。直接加到侧壁
上最好，还有自然的混匀过程,封口后离心。 |
x**e
发帖数: 163 | 16 SYBR green都是在4°保存的，应该不存在均匀与否的问题。cDNA模板都是加的2ul，但
体系是10ul的。回头想一想，还真有可能是离心的问题。我大周末之前做的都还行。周
末由于我们系没有平板离心机，而有离心机的老美实验室又没有人来，所以就图了方便
没有离心了，但加样的时候还是注意了这个问题的，特异加到管底，减少残留在管壁的
可能性。
再试试离心后的结果吧。多谢各位 |
i***l
发帖数: 1656 | 17 离心to mix well 是关键啊
【在 o**4 的大作中提到】
: 看样子，离心是关键啊
|
o**4
发帖数: 35028 | 18 re
【在 i***l 的大作中提到】
: 离心to mix well 是关键啊
|
C*********u
发帖数: 811 | 19 还有一种可能就是你的plate底部粘到了什么dust，肉眼可能看不到，但是会显著影响
你的CT值，所以我一般都把plate放在foil上做的
【在 x**e 的大作中提到】
: SYBR green都是在4°保存的，应该不存在均匀与否的问题。cDNA模板都是加的2ul，但
: 体系是10ul的。回头想一想，还真有可能是离心的问题。我大周末之前做的都还行。周
: 末由于我们系没有平板离心机，而有离心机的老美实验室又没有人来，所以就图了方便
: 没有离心了，但加样的时候还是注意了这个问题的，特异加到管底，减少残留在管壁的
: 可能性。
: 再试试离心后的结果吧。多谢各位
|
i*******l
发帖数: 2 | 20 “技术重复都是配成mixture然后pipet到3个well里面的，照理应该是绝对一样的啊，
分装的时候操作也很小心。”
大哥，技术重复不是那样做的！应该每样都分别加，才叫技术重复啊！
BTW，Master Mix和Primer, cDNA，水这些好像真还不那么容易混匀的。 |
|
|
i*******l
发帖数: 2 | 21 大哥，技术重复不是那样做的！应该每样都分别加，才叫技术重复啊！
BTW，Master Mix和Primer, cDNA，水这些好像真还不那么容易混匀的。
Ct
【在 x**e 的大作中提到】
: 用的是BIO-RAD的CFX-96 的机器，每个样品做3个技术重复，居然在3个技术重复里面Ct
: 值有2-3的差异。技术重复都是配成mixture然后pipet到3个well里面的，照理应该是绝
: 对一样的啊，分装的时候操作也很小心。
: 用的SYBR green是以前order的ROCHE公司的，在BIO-RAD的机器上做应该没有问题吧？
: 样品很珍贵，试了几次都快用光了，大家觉得有哪些可能原因？先谢了。
|
l*******9
发帖数: 47 | 22 感觉real time就是很不靠谱……
有把好枪才是关键…… |
a******7
发帖数: 7936 | 23 我们Sybr Green都在-20C保存，15ul体系，6ul cDNA。加完封口混匀了离心一小会。一
步都不能少
封口要把膜来回用力按紧好几次，从中间向边缘绕圈按，先按边缘中间容易鼓起来。
【在 x**e 的大作中提到】
: SYBR green都是在4°保存的，应该不存在均匀与否的问题。cDNA模板都是加的2ul，但
: 体系是10ul的。回头想一想，还真有可能是离心的问题。我大周末之前做的都还行。周
: 末由于我们系没有平板离心机，而有离心机的老美实验室又没有人来，所以就图了方便
: 没有离心了，但加样的时候还是注意了这个问题的，特异加到管底，减少残留在管壁的
: 可能性。
: 再试试离心后的结果吧。多谢各位
|
a******7
发帖数: 7936 | 24 刚来实验室两个中国师兄的枪都收拾的很好，每次用完放回架子上还把所有量程调到最
大。
后来来了两美国人，都是工作以后回来读PhD的，每次用完枪就放桌子上，桌子上
protocol，tube和开着盖子的枪头盒子堆得到处都是，再后来的师弟就跟着乱丢枪，有
的时候找不到就从别人架子上拿，拿完也不放回去，搞得现在实验室枪和枪头很乱，现
在都不敢做PCR了，就怕枪和枪头污染了。诶
【在 l*******9 的大作中提到】
: 感觉real time就是很不靠谱……
: 有把好枪才是关键……
|
