p*****m
发帖数: 7030 | 1 刚刚学了学怎么伺候鱼，交配，收集larvae blabla,同时做点分子实验，同时了解了解
大家都在干啥。基本还没入门。不过感觉和之前还是稍微有点不同的 对fish这个model
（只考虑非发育生物学的应用，这个做的已经没太大意思了）
small molecule screen还是仍旧给力。如果做能够take advantage of its transpare
ncy的东西也很给力，比如看看血液循环，心脏搏动之类的的，能用到fluorescent rep
orter的也不错（但是看下面）
同时开始觉得用fish做genetics不是那么爽了。做stable transgene时间太长，而且to
olkit比起果蝇和小鼠差得太远，不光是大类的工具不行，就是有的工具也需要很多很多
refinement才能到老鼠果蝇的完善程度（有些在改进），我现在开始觉得如果serious的
做fish genetics(forward or reverse)还不如小鼠来的爽。同时，fish吸引我的一大好
处是transient expression,这个的能量我还要继续发掘研究。以后要做genetics，也就
最多停留在这个步骤了
fish前辈们怎么看？ |
o**4
发帖数: 35028 | |
p****p
发帖数: 3360 | |
M*****n
发帖数: 16729 | 4 俺昨天不是说了，next big thing 就是knockout fish. 你应该朝这个方向努力。如果
你把这个做出来，虽然得不了炸药将，但是名气也不会小了。
developmental biology is pretty much over. don't waster your time on it.
pushing/shaking flies is good for beginners to learn genetics.
my 2 cents.
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好
【在 p*****m 的大作中提到】
: 刚刚学了学怎么伺候鱼，交配，收集larvae blabla,同时做点分子实验，同时了解了解
: 大家都在干啥。基本还没入门。不过感觉和之前还是稍微有点不同的 对fish这个model
: （只考虑非发育生物学的应用，这个做的已经没太大意思了）
: small molecule screen还是仍旧给力。如果做能够take advantage of its transpare
: ncy的东西也很给力，比如看看血液循环，心脏搏动之类的的，能用到fluorescent rep
: orter的也不错（但是看下面）
: 同时开始觉得用fish做genetics不是那么爽了。做stable transgene时间太长，而且to
: olkit比起果蝇和小鼠差得太远，不光是大类的工具不行，就是有的工具也需要很多很多
: refinement才能到老鼠果蝇的完善程度（有些在改进），我现在开始觉得如果serious的
: 做fish genetics(forward or reverse)还不如小鼠来的爽。同时，fish吸引我的一大好
|
p*****m
发帖数: 7030 | 5 有ZFN就够了吧 为啥一定要knockout fish?
我本来就是fly person, hehe。来试一下fish水多深，不行我还弄我的fly去。。
【在 M*****n 的大作中提到】
: 俺昨天不是说了，next big thing 就是knockout fish. 你应该朝这个方向努力。如果
: 你把这个做出来，虽然得不了炸药将，但是名气也不会小了。
: developmental biology is pretty much over. don't waster your time on it.
: pushing/shaking flies is good for beginners to learn genetics.
: my 2 cents.
:
: model
: transpare
: rep
: to
|
O******e
发帖数: 4845 | 6 这个很多人都在搞了吧，e.g.
http://www.genome.gov/25522120
【在 M*****n 的大作中提到】
: 俺昨天不是说了，next big thing 就是knockout fish. 你应该朝这个方向努力。如果
: 你把这个做出来，虽然得不了炸药将，但是名气也不会小了。
: developmental biology is pretty much over. don't waster your time on it.
: pushing/shaking flies is good for beginners to learn genetics.
: my 2 cents.
:
: model
: transpare
: rep
: to
|
M*****n
发帖数: 16729 | 7 ZFN不如homologous rec好。
有很多limitation.
你再读paper哦。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 有ZFN就够了吧 为啥一定要knockout fish?
: 我本来就是fly person, hehe。来试一下fish水多深，不行我还弄我的fly去。。
|
p*****m
发帖数: 7030 | 8 limitation是有，但是也可以改进吧 我最近正在谈的一个合作就是弄个更好用的ZFN
analog,你觉得一定要HM么？
【在 M*****n 的大作中提到】
: ZFN不如homologous rec好。
: 有很多limitation.
: 你再读paper哦。
|
M*****n
发帖数: 16729 | 9 retroviral insertion是老路子，但是也有limitation.
其实这就是NIH到中国去骗钱。
【在 O******e 的大作中提到】
: 这个很多人都在搞了吧，e.g.
: http://www.genome.gov/25522120
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M*****n
发帖数: 16729 | 10 knock-in, can you do it with ZFN?
【在 p*****m 的大作中提到】
: limitation是有，但是也可以改进吧 我最近正在谈的一个合作就是弄个更好用的ZFN
: analog,你觉得一定要HM么？
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|
p*****m
发帖数: 7030 | 11 对的 这个就是我正在谈的改进版。。哈哈 看来你们fish people觉得这个会是个重要的
东东咯？
【在 M*****n 的大作中提到】
: knock-in, can you do it with ZFN?
|
M*****n
发帖数: 16729 | 12 knock-in is a plus, 但是knock-out 最重要。
现在ZFN的效率太低了， 最多20%。你如果能弄一个比较efficiet的ZFN,比如80%, 那么
knock-in有没有也无所谓。
要的
【在 p*****m 的大作中提到】
: 对的 这个就是我正在谈的改进版。。哈哈 看来你们fish people觉得这个会是个重要的
: 东东咯？
|
p*****m
发帖数: 7030 | 13 我没明白，20%已经比老鼠HM高得多得多了啊 你是想在同代用ZFN做cKO?这样才需要考
虑不加筛选的效率问题吧
【在 M*****n 的大作中提到】
: knock-in is a plus, 但是knock-out 最重要。
: 现在ZFN的效率太低了， 最多20%。你如果能弄一个比较efficiet的ZFN,比如80%, 那么
: knock-in有没有也无所谓。
:
: 要的
|
M*****n
发帖数: 16729 | 14 俺对ZFN这个field知道不多,
好像作knock-in，还是要靠hom rec的， 虽然ZFN可以有所帮助。
要的
【在 p*****m 的大作中提到】
: 对的 这个就是我正在谈的改进版。。哈哈 看来你们fish people觉得这个会是个重要的
: 东东咯？
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p*****m
发帖数: 7030 | 15 是的
【在 M*****n 的大作中提到】
: 俺对ZFN这个field知道不多,
: 好像作knock-in，还是要靠hom rec的， 虽然ZFN可以有所帮助。
:
: 要的
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M*****n
发帖数: 16729 | 16 you are smart.
其实对于fish来说，有无knock-in无所谓，可以有别的途径，但是要做cKO, 就麻烦了。
你要不想想这个怎么弄吧。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 我没明白，20%已经比老鼠HM高得多得多了啊 你是想在同代用ZFN做cKO?这样才需要考
: 虑不加筛选的效率问题吧
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p*****m
发帖数: 7030 | 17 嗯 我今天才看到个paper可以用在这个上面 哈 你觉得做出来这个会有多大用呢？对
fish people来说，我一个外人没感觉。。
了。
【在 M*****n 的大作中提到】
: you are smart.
: 其实对于fish来说，有无knock-in无所谓，可以有别的途径，但是要做cKO, 就麻烦了。
: 你要不想想这个怎么弄吧。
|
M*****n
发帖数: 16729 | 18 really? which paper?
I am planning to hire a postdoc to work on that. maybe it is too late.
【在 p*****m 的大作中提到】
: 嗯 我今天才看到个paper可以用在这个上面 哈 你觉得做出来这个会有多大用呢？对
: fish people来说，我一个外人没感觉。。
:
: 了。
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s******y
发帖数: 28562 | 19 鱼的好处就是身体透明，而且发育过程都在体外吧
要是什么时候做老鼠的搞出了人造老鼠子宫，你们做鱼的就可以去摆摊卖鱼了。
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好
【在 p*****m 的大作中提到】
: 刚刚学了学怎么伺候鱼，交配，收集larvae blabla,同时做点分子实验，同时了解了解
: 大家都在干啥。基本还没入门。不过感觉和之前还是稍微有点不同的 对fish这个model
: （只考虑非发育生物学的应用，这个做的已经没太大意思了）
: small molecule screen还是仍旧给力。如果做能够take advantage of its transpare
: ncy的东西也很给力，比如看看血液循环，心脏搏动之类的的，能用到fluorescent rep
: orter的也不错（但是看下面）
: 同时开始觉得用fish做genetics不是那么爽了。做stable transgene时间太长，而且to
: olkit比起果蝇和小鼠差得太远，不光是大类的工具不行，就是有的工具也需要很多很多
: refinement才能到老鼠果蝇的完善程度（有些在改进），我现在开始觉得如果serious的
: 做fish genetics(forward or reverse)还不如小鼠来的爽。同时，fish吸引我的一大好
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M*****n
发帖数: 16729 | 20 p同学是push fly的。
【在 s******y 的大作中提到】
: 鱼的好处就是身体透明，而且发育过程都在体外吧
: 要是什么时候做老鼠的搞出了人造老鼠子宫，你们做鱼的就可以去摆摊卖鱼了。
:
: model
: transpare
: rep
: to
: 很多
: serious的
: 大好
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s******y
发帖数: 28562 | 21 偶知道，他现在不是想去做鱼么，所以我要给他浇点冷水。
鱼还有一个坏事，就是很多抗体都没有卖的。很多实验室都是索性自己做一个。
幸好据说互相之间不是很难借到。但是万一碰到不耐斯的人，就麻烦了。
【在 M*****n 的大作中提到】
: p同学是push fly的。
|
M*****n
发帖数: 16729 | 22 这个市场太小。
以前有个公司打算专门作fish 的抗体，不过不知道现在怎么样了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 偶知道，他现在不是想去做鱼么，所以我要给他浇点冷水。
: 鱼还有一个坏事，就是很多抗体都没有卖的。很多实验室都是索性自己做一个。
: 幸好据说互相之间不是很难借到。但是万一碰到不耐斯的人，就麻烦了。
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a********k
发帖数: 2273 | 23 anaspec and GeneTex got hundreds antibodies for fish. Better than nothing.
【在 M*****n 的大作中提到】
: 这个市场太小。
: 以前有个公司打算专门作fish 的抗体，不过不知道现在怎么样了。
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M*****n
发帖数: 16729 | 24 那些都是verified antibody, 不是专门为fish protein做的。
【在 a********k 的大作中提到】
: anaspec and GeneTex got hundreds antibodies for fish. Better than nothing.
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a********k
发帖数: 2273 | 25 credit肯定要给的，至于能给多大的话，我估计至少比rat KO的credit的零头多吧
【在 p*****m 的大作中提到】
: 嗯 我今天才看到个paper可以用在这个上面 哈 你觉得做出来这个会有多大用呢？对
: fish people来说，我一个外人没感觉。。
:
: 了。
|
a********k
发帖数: 2273 | 26 他们新做的，大部分都没有verify，如果你有兴趣verify，他们会免费给你的
【在 M*****n 的大作中提到】
: 那些都是verified antibody, 不是专门为fish protein做的。
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p*****m
发帖数: 7030 | 27 你这个冷水。。。鱼透明这个好处是替代不了的 而且人家体外受精 你们老鼠行么。。
呵呵
【在 s******y 的大作中提到】
: 偶知道，他现在不是想去做鱼么，所以我要给他浇点冷水。
: 鱼还有一个坏事，就是很多抗体都没有卖的。很多实验室都是索性自己做一个。
: 幸好据说互相之间不是很难借到。但是万一碰到不耐斯的人，就麻烦了。
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p*****m
发帖数: 7030 | 28 这么差？要说fish cKO应该还是挺有用的吧
【在 a********k 的大作中提到】
: credit肯定要给的，至于能给多大的话，我估计至少比rat KO的credit的零头多吧
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O******e
发帖数: 4845 | 29 以后我如果有闲工夫就搞搞这个老鼠的体外受精，呵呵
【在 p*****m 的大作中提到】
: 你这个冷水。。。鱼透明这个好处是替代不了的 而且人家体外受精 你们老鼠行么。。
: 呵呵
|
a********k
发帖数: 2273 | 30 个人意见。。。从悲观的角度出发而已
【在 p*****m 的大作中提到】
: 这么差？要说fish cKO应该还是挺有用的吧
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s******y
发帖数: 28562 | 31 关键是做出来之后又不知道和人的系统有没有差别。
弄不好又白做了。白白发展一个技术作出来的东西都不知道有什么意义。
否则大家干吗拼死拼活的要上老鼠和大鼠？图的就是这个哺乳动物和人比较接近。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 这么差？要说fish cKO应该还是挺有用的吧
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p*****m
发帖数: 7030 | 32 要我说这个是urban legend，rodent比human还是差得远
而且 从我一个fly person的眼光看来，rodent model对生物学的贡献比线虫和果蝇的零
头都不如
【在 s******y 的大作中提到】
: 关键是做出来之后又不知道和人的系统有没有差别。
: 弄不好又白做了。白白发展一个技术作出来的东西都不知道有什么意义。
: 否则大家干吗拼死拼活的要上老鼠和大鼠？图的就是这个哺乳动物和人比较接近。
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p*****m
发帖数: 7030 | 33 哦。。
【在 a********k 的大作中提到】
: 个人意见。。。从悲观的角度出发而已
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a********k
发帖数: 2273 | 34 但是你就觉得鱼比rodent有更多贡献？线虫和果蝇的贡献咱暂且不提，鱼到现在基本可
以说是零贡献。。。有了cKO以后有没有零头还是个问题
的零
【在 p*****m 的大作中提到】
: 要我说这个是urban legend，rodent比human还是差得远
: 而且 从我一个fly person的眼光看来，rodent model对生物学的贡献比线虫和果蝇的零
: 头都不如
|
s********r
发帖数: 312 | 35 ZFN做knock-in的话大片段像2kb以上就不太好插入了，而且效率也低，做老鼠的话打那
么多embryo，还要都生出来做genotyping,都是钱啊... 鱼的我不懂，可能便宜很多吧 |
s******y
发帖数: 28562 | 36 rodent 好歹是个哺乳动物啊。
鱼啊什么的和人也差的太远了
的零
【在 p*****m 的大作中提到】
: 要我说这个是urban legend，rodent比human还是差得远
: 而且 从我一个fly person的眼光看来，rodent model对生物学的贡献比线虫和果蝇的零
: 头都不如
|
A******y
发帖数: 2041 | 37 Sigma will do it for ~25k...any gene anywhere as far as I understood.
【在 M*****n 的大作中提到】
: knock-in is a plus, 但是knock-out 最重要。
: 现在ZFN的效率太低了， 最多20%。你如果能弄一个比较efficiet的ZFN,比如80%, 那么
: knock-in有没有也无所谓。
:
: 要的
|
p*****m
发帖数: 7030 | 38 哦 这个是自然 fish的贡献就是0...所以我才不sure这个有多有意义
话说回来，不管有没有意义 只要fish community觉得有用给我个job就行啊 也不用非
要想得那么长远不是 呵呵
【在 a********k 的大作中提到】
: 但是你就觉得鱼比rodent有更多贡献？线虫和果蝇的贡献咱暂且不提，鱼到现在基本可
: 以说是零贡献。。。有了cKO以后有没有零头还是个问题
:
: 的零
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p*****m
发帖数: 7030 | 39 用ZFN做直接knockin是不行的（也就老鼠还行，人细胞和fish的HM比率都非常低）
【在 s********r 的大作中提到】
: ZFN做knock-in的话大片段像2kb以上就不太好插入了，而且效率也低，做老鼠的话打那
: 么多embryo，还要都生出来做genotyping,都是钱啊... 鱼的我不懂，可能便宜很多吧
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a********k
发帖数: 2273 | 40 显然会有人给job啊，而且不是少数
搞tool的几个fish lab都混得不错啊，搞出Tol2的日本人就不说了
发展Tol2的chien在fish community里面就很有地位了
其他搞Tool的人，做MO的Ekker，搞出virus insertion的hopkins都很有地位
【在 p*****m 的大作中提到】
: 哦 这个是自然 fish的贡献就是0...所以我才不sure这个有多有意义
: 话说回来，不管有没有意义 只要fish community觉得有用给我个job就行啊 也不用非
: 要想得那么长远不是 呵呵
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p*****m
发帖数: 7030 | 41 then it is good enough, lol
啥时候msn找你聊哈
【在 a********k 的大作中提到】
: 显然会有人给job啊，而且不是少数
: 搞tool的几个fish lab都混得不错啊，搞出Tol2的日本人就不说了
: 发展Tol2的chien在fish community里面就很有地位了
: 其他搞Tool的人，做MO的Ekker，搞出virus insertion的hopkins都很有地位
|
M*****n
发帖数: 16729 | 42 Chi-Bin Chien, Steve Ekker, Kawakami不光是搞了tool.
他们搞这些tool之前早就有地位了。
Nancy Hopkins也就是资格老一点，其实没作出什么大的东西。那个insertion的idea也
很普通。
【在 a********k 的大作中提到】
: 显然会有人给job啊，而且不是少数
: 搞tool的几个fish lab都混得不错啊，搞出Tol2的日本人就不说了
: 发展Tol2的chien在fish community里面就很有地位了
: 其他搞Tool的人，做MO的Ekker，搞出virus insertion的hopkins都很有地位
|
M*****n
发帖数: 16729 | 43 Sigma will validate the ZFN in vitro, you have to test it in fish by
yourself.
it is too risky and too expensive.
【在 A******y 的大作中提到】
: Sigma will do it for ~25k...any gene anywhere as far as I understood.
|
a********k
发帖数: 2273 | 44 请教一下Chien, Ekker, Kawakami, Hopkins比Tool明显高一个档次的贡献。
Hopkins也算是纯做zebrafish唯一的院士了吧，其实整个领域就没作出啥东西。。。
【在 M*****n 的大作中提到】
: Chi-Bin Chien, Steve Ekker, Kawakami不光是搞了tool.
: 他们搞这些tool之前早就有地位了。
: Nancy Hopkins也就是资格老一点，其实没作出什么大的东西。那个insertion的idea也
: 很普通。
|
f**u
发帖数: 346 | 45 如果你先用ZFN来KI一个attP，然后再把你要的片断钉进去怎么样
【在 p*****m 的大作中提到】
: 用ZFN做直接knockin是不行的（也就老鼠还行，人细胞和fish的HM比率都非常低）
|
f**u
发帖数: 346 | 46 我看了几个帖子有点晕了，ZFN的目的不就是增加HR的效率吗？
难道在鱼里面，ZFN有什么其它的用处？
【在 M*****n 的大作中提到】
: ZFN不如homologous rec好。
: 有很多limitation.
: 你再读paper哦。
|
F*K
发帖数: 608 | 47 给科普一下Ekker的贡献把，看来我是有眼不识泰山了。。
【在 M*****n 的大作中提到】
: Chi-Bin Chien, Steve Ekker, Kawakami不光是搞了tool.
: 他们搞这些tool之前早就有地位了。
: Nancy Hopkins也就是资格老一点，其实没作出什么大的东西。那个insertion的idea也
: 很普通。
|
f**u
发帖数: 346 | 48 如果你下决心做鱼了，我看不如把MARCM给移植到鱼里面，这样长期的贡献应该不小。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 哦 这个是自然 fish的贡献就是0...所以我才不sure这个有多有意义
: 话说回来，不管有没有意义 只要fish community觉得有用给我个job就行啊 也不用非
: 要想得那么长远不是 呵呵
|
a********k
发帖数: 2273 | 49 MARCM不是那么容易移植的。。。没有cKO移植了贡献有限
而且鱼的工作绝大部分在幼鱼里面做，要trace cell linage基本用transient
expression或者transplantation了。MARCM的优势比起在老鼠里面小无数倍。
【在 f**u 的大作中提到】
: 如果你下决心做鱼了，我看不如把MARCM给移植到鱼里面，这样长期的贡献应该不小。
|
i*****g
发帖数: 11893 | 50 问一个问题，
我现在一个相关project是 zfn， target 就不说了，虽然说了也没有什么。
问题是经理是个 adeno viral控，什么都往那里面装
这个zfn对adeno packing有多少影响？ 是否包装困难？（当然，我知道文献有成功报
导，不过，我历来是非常negative,） |
|
|
g*********5
发帖数: 2533 | 51 haha
摆摊卖鱼了
【在 s******y 的大作中提到】
: 鱼的好处就是身体透明，而且发育过程都在体外吧
: 要是什么时候做老鼠的搞出了人造老鼠子宫，你们做鱼的就可以去摆摊卖鱼了。
:
: model
: transpare
: rep
: to
: 很多
: serious的
: 大好
|
O******e
发帖数: 4845 | 52 你要这样说，大肠杆菌的贡献可比线虫和果蝇的还要大。
这都是历史发展的不同阶段；可要是倒过来走，似乎就有些说不通了。
的零
【在 p*****m 的大作中提到】
: 要我说这个是urban legend，rodent比human还是差得远
: 而且 从我一个fly person的眼光看来，rodent model对生物学的贡献比线虫和果蝇的零
: 头都不如
|
A****A
发帖数: 16 | 53 具我所知，几个fish labs正在联合用ZFN搞大规模的knock out resources。ZFN以及相
关技术最近会有比较大的进展。大家如果感兴趣，可以关注一下最近的TALEN技术。在
最近1-2年内，估计任何试验室都可以自己合成reagent去target任何基因。cost不会比
买限制性内切酶高太多。
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好
【在 p*****m 的大作中提到】
: 刚刚学了学怎么伺候鱼，交配，收集larvae blabla,同时做点分子实验，同时了解了解
: 大家都在干啥。基本还没入门。不过感觉和之前还是稍微有点不同的 对fish这个model
: （只考虑非发育生物学的应用，这个做的已经没太大意思了）
: small molecule screen还是仍旧给力。如果做能够take advantage of its transpare
: ncy的东西也很给力，比如看看血液循环，心脏搏动之类的的，能用到fluorescent rep
: orter的也不错（但是看下面）
: 同时开始觉得用fish做genetics不是那么爽了。做stable transgene时间太长，而且to
: olkit比起果蝇和小鼠差得太远，不光是大类的工具不行，就是有的工具也需要很多很多
: refinement才能到老鼠果蝇的完善程度（有些在改进），我现在开始觉得如果serious的
: 做fish genetics(forward or reverse)还不如小鼠来的爽。同时，fish吸引我的一大好
|
l**********n
发帖数: 8443 | 54 在fish lab钓鱼是不是很有乐趣？
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好
【在 p*****m 的大作中提到】
: 刚刚学了学怎么伺候鱼，交配，收集larvae blabla,同时做点分子实验，同时了解了解
: 大家都在干啥。基本还没入门。不过感觉和之前还是稍微有点不同的 对fish这个model
: （只考虑非发育生物学的应用，这个做的已经没太大意思了）
: small molecule screen还是仍旧给力。如果做能够take advantage of its transpare
: ncy的东西也很给力，比如看看血液循环，心脏搏动之类的的，能用到fluorescent rep
: orter的也不错（但是看下面）
: 同时开始觉得用fish做genetics不是那么爽了。做stable transgene时间太长，而且to
: olkit比起果蝇和小鼠差得太远，不光是大类的工具不行，就是有的工具也需要很多很多
: refinement才能到老鼠果蝇的完善程度（有些在改进），我现在开始觉得如果serious的
: 做fish genetics(forward or reverse)还不如小鼠来的爽。同时，fish吸引我的一大好
|
p*****m
发帖数: 7030 | 55 bingo!
【在 f**u 的大作中提到】
: 如果你先用ZFN来KI一个attP，然后再把你要的片断钉进去怎么样
|
p*****m
发帖数: 7030 | 56 ZFN在鱼里目前就是用来造成NHEJ来形成mutation的 你说这个增加HR效率的事情 目前
好像还停留在我脑子里 当然也许已经有人开做了:)
【在 f**u 的大作中提到】
: 我看了几个帖子有点晕了，ZFN的目的不就是增加HR的效率吗？
: 难道在鱼里面，ZFN有什么其它的用处？
|
p*****m
发帖数: 7030 | 57 MARCM困难 但是用基于cre的方法应该还好吧（就像老鼠的MADM） 问题就像你说的 这
个东西感觉不大有用 transient expression本来就已经mosaic了反正。就像marcm在果
蝇里用的很广泛 但是madm就没有什么人care，因为老鼠大家随便用virus搞mosaic
【在 a********k 的大作中提到】
: MARCM不是那么容易移植的。。。没有cKO移植了贡献有限
: 而且鱼的工作绝大部分在幼鱼里面做，要trace cell linage基本用transient
: expression或者transplantation了。MARCM的优势比起在老鼠里面小无数倍。
|
p*****m
发帖数: 7030 | 58 倒过来走谈不上吧 线虫上一个贡献的nobel prize才不过是几年前的事情(08年martin
chalfie) 再上一个也没几年（06 Fire&Mello）。这个和E Coli是完全不一样的。。再
说近的，过去10年对小RNA的理解，从miRNA到piRNA，都是线虫+果蝇里来的；Janelia更
是卯足了劲要把fly的事情搞清楚。这两个model system的用处还远没有开发完呢
【在 O******e 的大作中提到】
: 你要这样说，大肠杆菌的贡献可比线虫和果蝇的还要大。
: 这都是历史发展的不同阶段；可要是倒过来走，似乎就有些说不通了。
:
: 的零
|
p*****m
发帖数: 7030 | 59 ZFN+TALEN做KO还是可以的 不过就像Morphin说的，光KO感觉并没啥太大意思了。 要说
fish mutants也大把大把的了 现在缺的并不是一个简单的KO工具感觉。有KI和cKO也许
能好一点
TALEN本来我想在鱼里做一下来着 就当练手 结果还没谈好合作就被发掉了(上周scienc
e, barbara Meyer在线虫里做了) 我就没兴趣在fish里再proof of principle一把了。
。而且也听说有别的fish lab做
【在 A****A 的大作中提到】
: 具我所知，几个fish labs正在联合用ZFN搞大规模的knock out resources。ZFN以及相
: 关技术最近会有比较大的进展。大家如果感兴趣，可以关注一下最近的TALEN技术。在
: 最近1-2年内，估计任何试验室都可以自己合成reagent去target任何基因。cost不会比
: 买限制性内切酶高太多。
:
: model
: transpare
: rep
: to
: 很多
|
y******8
发帖数: 1764 | 60 Chemical screening is so powerful in fish and probably the only thing worth
pursuing if you want a easy-pass for your career. I have seen lots of young
fish scientists miserably failed by just doing genetics. |
|
|
p*****m
发帖数: 7030 | 61 我差不多现在就是这个想法哈
worth
young
【在 y******8 的大作中提到】
: Chemical screening is so powerful in fish and probably the only thing worth
: pursuing if you want a easy-pass for your career. I have seen lots of young
: fish scientists miserably failed by just doing genetics.
|
X******n
发帖数: 914 | 62 感觉fish这个model如果真会有贡献的话，可能最主要会在chemical genomics方面，在
血液病方面可能也有些优势。其它方面没觉得有很大优势。一些大动物模型会慢慢发展
起来，觉得国内在这方面有很大优势。 |
a********k
发帖数: 2273 | 63 血液也很难讲。。。不是做血液的，但是不看好。
光从现在的结果来看，鱼的血液发育和哺乳类差别很大了
之所以现在做的人那么多是因为primitive hematopoeisis在老鼠里面压根没法做，鱼
胚胎用来做卵黄囊造血是再好不过的model了。但是血液病大多数还是骨髓干细胞的问
题，感觉用鱼来做这个也就是个忽悠。不知道做血液的怎么看？
【在 X******n 的大作中提到】
: 感觉fish这个model如果真会有贡献的话，可能最主要会在chemical genomics方面，在
: 血液病方面可能也有些优势。其它方面没觉得有很大优势。一些大动物模型会慢慢发展
: 起来，觉得国内在这方面有很大优势。
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y******8
发帖数: 1764 | 64 No only for hematopoietic system. Basically, you can screen for any
phenotype, but use soluble molecules instead of genetic methods. By this way
, you would directly get drug candidates, not just drug target candidates.
The transparency of fish embryo is overstated. If you want deal with any
late-onset disease, the adult fish is not very transparent.
【在 X******n 的大作中提到】
: 感觉fish这个model如果真会有贡献的话，可能最主要会在chemical genomics方面，在
: 血液病方面可能也有些优势。其它方面没觉得有很大优势。一些大动物模型会慢慢发展
: 起来，觉得国内在这方面有很大优势。
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X******n
发帖数: 914 | 65 you would directly get drug candidates, not just drug target candidates.
展开谈谈？ |
p*****m
发帖数: 7030 | 66 这个只能说是科幻吧 不觉得fish small molecule screen能直接拿到drug candidate
way
【在 y******8 的大作中提到】
: No only for hematopoietic system. Basically, you can screen for any
: phenotype, but use soluble molecules instead of genetic methods. By this way
: , you would directly get drug candidates, not just drug target candidates.
: The transparency of fish embryo is overstated. If you want deal with any
: late-onset disease, the adult fish is not very transparent.
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A****A
发帖数: 16 | 67 利用ZFN等reagents做Knock in应该是一些lab目前的奋斗方向。ZFN可以产生sequence
specific DNA double strand break. DNA双链断裂可以有效的提高homologous
recombination的频率，从而达到Knock in的目的。目前，在fish里面实现高效的HR还
很困难，即使在有ZFN的帮助下。我不是做fish的，主要做DNA repair pathway. 我觉
得可以通过一些genetic或chemical的手段抑制fish的NHEJ pathway，来增加HR的频率。
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好
【在 p*****m 的大作中提到】
: 刚刚学了学怎么伺候鱼，交配，收集larvae blabla,同时做点分子实验，同时了解了解
: 大家都在干啥。基本还没入门。不过感觉和之前还是稍微有点不同的 对fish这个model
: （只考虑非发育生物学的应用，这个做的已经没太大意思了）
: small molecule screen还是仍旧给力。如果做能够take advantage of its transpare
: ncy的东西也很给力，比如看看血液循环，心脏搏动之类的的，能用到fluorescent rep
: orter的也不错（但是看下面）
: 同时开始觉得用fish做genetics不是那么爽了。做stable transgene时间太长，而且to
: olkit比起果蝇和小鼠差得太远，不光是大类的工具不行，就是有的工具也需要很多很多
: refinement才能到老鼠果蝇的完善程度（有些在改进），我现在开始觉得如果serious的
: 做fish genetics(forward or reverse)还不如小鼠来的爽。同时，fish吸引我的一大好
|
y******8
发帖数: 1764 | 68 You could modify these small molecules into real drugs. If you have a good
synthetic chemistry lab to cooperate with, why not.
candidate
【在 p*****m 的大作中提到】
: 这个只能说是科幻吧 不觉得fish small molecule screen能直接拿到drug candidate
:
: way
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p*****m
发帖数: 7030 | 69 嗯 这几天刚有paper出来show这个的。请问一下有什么具体思路来一直NHEJ,然后这个
为什么能促进HR呢？我对这些分子生物学东东一窍不通 要是有相关文献就更好了哈 多
谢多谢
sequence
率。
【在 A****A 的大作中提到】
: 利用ZFN等reagents做Knock in应该是一些lab目前的奋斗方向。ZFN可以产生sequence
: specific DNA double strand break. DNA双链断裂可以有效的提高homologous
: recombination的频率，从而达到Knock in的目的。目前，在fish里面实现高效的HR还
: 很困难，即使在有ZFN的帮助下。我不是做fish的，主要做DNA repair pathway. 我觉
: 得可以通过一些genetic或chemical的手段抑制fish的NHEJ pathway，来增加HR的频率。
:
: model
: transpare
: rep
: to
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A******y
发帖数: 2041 | 70 Drug screen is possible in zebrafish, I have one of this in my collaborator'
s lab. 96 wells zebrafish behavior monitoring chamber.
http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/daniovi |
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X******n
发帖数: 914 | 71 从drug screen 到Drug candidates，还有很长的路要走。
collaborator'
【在 A******y 的大作中提到】
: Drug screen is possible in zebrafish, I have one of this in my collaborator'
: s lab. 96 wells zebrafish behavior monitoring chamber.
: http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/daniovi
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A******y
发帖数: 2041 | 72 True, but it is good enough to publish paper :)
【在 X******n 的大作中提到】
: 从drug screen 到Drug candidates，还有很长的路要走。
:
: collaborator'
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G*****m
发帖数: 198 | 73 插个loxP,attP之类的就很好用了。。。
【在 s********r 的大作中提到】
: ZFN做knock-in的话大片段像2kb以上就不太好插入了，而且效率也低，做老鼠的话打那
: 么多embryo，还要都生出来做genotyping,都是钱啊... 鱼的我不懂，可能便宜很多吧
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G*****m
发帖数: 198 | 74 因为个儿小，做neural circuit很有优势，能比较容易看到整个功能区的细胞活动，不
像老鼠只见树木不见森林。
model
transpare
rep
to
很多
serious的
大好
【在 p*****m 的大作中提到】
: 刚刚学了学怎么伺候鱼，交配，收集larvae blabla,同时做点分子实验，同时了解了解
: 大家都在干啥。基本还没入门。不过感觉和之前还是稍微有点不同的 对fish这个model
: （只考虑非发育生物学的应用，这个做的已经没太大意思了）
: small molecule screen还是仍旧给力。如果做能够take advantage of its transpare
: ncy的东西也很给力，比如看看血液循环，心脏搏动之类的的，能用到fluorescent rep
: orter的也不错（但是看下面）
: 同时开始觉得用fish做genetics不是那么爽了。做stable transgene时间太长，而且to
: olkit比起果蝇和小鼠差得太远，不光是大类的工具不行，就是有的工具也需要很多很多
: refinement才能到老鼠果蝇的完善程度（有些在改进），我现在开始觉得如果serious的
: 做fish genetics(forward or reverse)还不如小鼠来的爽。同时，fish吸引我的一大好
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A****A
发帖数: 16 | 75 目前的观点是，HR和NHEJ是在DNA双链断裂修复中互相竞争的pathways。如果能够有效
的抑制NHEJ,HR的频率有可能会有大幅度的提升。目前，一些labs主要通过knock out或
者knock down NHEJ中几个关键player， 比如，Ku70， Ku80 以及Ligase4，来进行验
证。比较convincing的data有Dana Carroll在果蝇的研究，以及Eric Hendrickson在
mammalian cell line中的研究。Paper 如下:
Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jun 24;105(25):8703-8. Epub 2008 Jun 18.
Ku70, an essential gene, modulates the frequency of rAAV-mediated gene
targeting in human somatic cells.
Fattah FJ, Lichter NF, Fattah KR, Oh S, Hendrickson EA.
Genetics. 2009 Jul;182(3):641-51. Epub 2009 Apr 20.
Genetic analysis of zinc-finger nuclease-induced gene targeting in
Drosophila.
Bozas A, Beumer KJ, Trautman JK, Carroll D.
不过，细胞究竟会使用什么pathway修复双链断裂应该复杂得多。至少细胞周期和发育
阶段也会对pathway的选择有很大影响。我曾经和一个做fish的PI聊过为什么ZFN-
mediated HR在fish里的效果这么不理想。他的看法是fish的embryo发育太快，所以一
旦有双链断裂需要修复，细胞会采取最快捷的NHEJ来修复，而不是需要更多时间和能量
的HR.
【在 p*****m 的大作中提到】
: 嗯 这几天刚有paper出来show这个的。请问一下有什么具体思路来一直NHEJ,然后这个
: 为什么能促进HR呢？我对这些分子生物学东东一窍不通 要是有相关文献就更好了哈 多
: 谢多谢
:
: sequence
: 率。
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G*****m
发帖数: 198 | 76 哈，这个主题帖很多给力的内容
【在 A****A 的大作中提到】
: 目前的观点是，HR和NHEJ是在DNA双链断裂修复中互相竞争的pathways。如果能够有效
: 的抑制NHEJ,HR的频率有可能会有大幅度的提升。目前，一些labs主要通过knock out或
: 者knock down NHEJ中几个关键player， 比如，Ku70， Ku80 以及Ligase4，来进行验
: 证。比较convincing的data有Dana Carroll在果蝇的研究，以及Eric Hendrickson在
: mammalian cell line中的研究。Paper 如下:
: Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jun 24;105(25):8703-8. Epub 2008 Jun 18.
: Ku70, an essential gene, modulates the frequency of rAAV-mediated gene
: targeting in human somatic cells.
: Fattah FJ, Lichter NF, Fattah KR, Oh S, Hendrickson EA.
: Genetics. 2009 Jul;182(3):641-51. Epub 2009 Apr 20.
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f**u
发帖数: 346 | 77 double stranded DNA break会增加HR的效率，这个应该是一个普遍现象。
所以对于ZFN来说，增加HR这个根本不需要去做，因为它本身就在那里。
我觉得可能是鱼的重组效率实在太低，就算诱导了DNA break也还是很低。
【在 p*****m 的大作中提到】
: ZFN在鱼里目前就是用来造成NHEJ来形成mutation的 你说这个增加HR效率的事情 目前
: 好像还停留在我脑子里 当然也许已经有人开做了:)
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p*****m
发帖数: 7030 | 78 我知道你的意思 我是说没人在fish里真的去好好试用ZFN做HR
【在 f**u 的大作中提到】
: double stranded DNA break会增加HR的效率，这个应该是一个普遍现象。
: 所以对于ZFN来说，增加HR这个根本不需要去做，因为它本身就在那里。
: 我觉得可能是鱼的重组效率实在太低，就算诱导了DNA break也还是很低。
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f**u
发帖数: 346 | 79 如果原因真的是像你提到的这个PI说得这样的话，可以试试germline transformation
【在 A****A 的大作中提到】
: 目前的观点是，HR和NHEJ是在DNA双链断裂修复中互相竞争的pathways。如果能够有效
: 的抑制NHEJ,HR的频率有可能会有大幅度的提升。目前，一些labs主要通过knock out或
: 者knock down NHEJ中几个关键player， 比如，Ku70， Ku80 以及Ligase4，来进行验
: 证。比较convincing的data有Dana Carroll在果蝇的研究，以及Eric Hendrickson在
: mammalian cell line中的研究。Paper 如下:
: Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jun 24;105(25):8703-8. Epub 2008 Jun 18.
: Ku70, an essential gene, modulates the frequency of rAAV-mediated gene
: targeting in human somatic cells.
: Fattah FJ, Lichter NF, Fattah KR, Oh S, Hendrickson EA.
: Genetics. 2009 Jul;182(3):641-51. Epub 2009 Apr 20.
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x**w
发帖数: 112 | 80 ＵC Berkeley的Sharon Amacher 2010年fish meeting上就有post说在抑制NHEJ的条
件下促进hr的尝试，当时已经拿到heters 了，搞不好过两天文章就出来了，大家还在
这里扯。。。。呵呵。。。
transformation
【在 f**u 的大作中提到】
: 如果原因真的是像你提到的这个PI说得这样的话，可以试试germline transformation
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i*****g
发帖数: 11893 | 81 NHEJ HR
我2003年就接触了，也是个焦头烂额的领域
发文章是可以的
但要指望它做些事情，提高HR之类的，这个叫产品，或工具。从文章到产品 还有一段路
生物系统，凡是卷入N个蛋白，别指望容易的事情 |
m******5
发帖数: 1383 | 82 老鼠可以体外受精阿……JAX lab rescue老line就用这个的，5000刀一个Line
还有用IVF高速expand所需要的line
【在 O******e 的大作中提到】
: 以后我如果有闲工夫就搞搞这个老鼠的体外受精，呵呵
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m******5
发帖数: 1383 | 83 老鼠Knock in打的是mES cell,挑 colony,体力活，但是不难
【在 G*****m 的大作中提到】
: 插个loxP,attP之类的就很好用了。。。
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X******n
发帖数: 914 | 84 我好像看到老板在审一篇用ＺＦＮ做Ｋｎｏｃｋｉｎ的文章，发到Ｎａｔｕｒｅ上的。 |
p*****m
发帖数: 7030 | 85 你说的我赶紧去翻了一下abs book和笔记，他们好像没提成功了啊 去年的会上有好几
家号称在用ZFN直接做KI，没有一个说自己看到成功了。
【在 x**w 的大作中提到】
: ＵC Berkeley的Sharon Amacher 2010年fish meeting上就有post说在抑制NHEJ的条
: 件下促进hr的尝试，当时已经拿到heters 了，搞不好过两天文章就出来了，大家还在
: 这里扯。。。。呵呵。。。
:
: transformation
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s********r
发帖数: 312 | 86 再仔细讲讲嘛。
【在 X******n 的大作中提到】
: 我好像看到老板在审一篇用ＺＦＮ做Ｋｎｏｃｋｉｎ的文章，发到Ｎａｔｕｒｅ上的。
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X******n
发帖数: 914 | 87 我问了一下，他说不是在fish里做的。我搞错了。
【在 s********r 的大作中提到】
: 再仔细讲讲嘛。
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x**w
发帖数: 112 | 88 我又去翻了下我的笔记。。呵呵。。
更正一下，是拿到了chimera fish
【在 p*****m 的大作中提到】
: 你说的我赶紧去翻了一下abs book和笔记，他们好像没提成功了啊 去年的会上有好几
: 家号称在用ZFN直接做KI，没有一个说自己看到成功了。
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f**u
发帖数: 346 | 89 这个嘛，关键看能不能把germline给KI了。
【在 x**w 的大作中提到】
: 我又去翻了下我的笔记。。呵呵。。
: 更正一下，是拿到了chimera fish
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c******m
发帖数: 884 | 90 knock-in 和 knock-out 有啥区别阿？
【在 M*****n 的大作中提到】
: 俺对ZFN这个field知道不多,
: 好像作knock-in，还是要靠hom rec的， 虽然ZFN可以有所帮助。
:
: 要的
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M*****n
发帖数: 16729 | 91 老鼠还是鱼？
rat去年就发到nature biotech上了。
【在 X******n 的大作中提到】
: 我好像看到老板在审一篇用ＺＦＮ做Ｋｎｏｃｋｉｎ的文章，发到Ｎａｔｕｒｅ上的。
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M*****n
发帖数: 16729 | 92 下一步就是要拿到germline
光是chimera 还发不了大paper.
其实HR肯定可以发生，就是效率太低。
俺有一个想法就是
如果直接manipulate embryos效率太低的话，可以先转一个artificial chromosome作
一个stableline.然后跟抑制NHJR的mutant line cross，然后后代筛选homologous
recombinants.
鱼能产很多卵，筛选几万个应该不难。 |
p*******r
发帖数: 4048 | 93 我最近在研究全老鼠的imaging...
技术上最近还是颇有些新方法的， 我觉得以后看个胚胎应该是可以的。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 你这个冷水。。。鱼透明这个好处是替代不了的 而且人家体外受精 你们老鼠行么。。
: 呵呵
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p*******r
发帖数: 4048 | 94 TALE 其实还暂时没那么好。
【在 A****A 的大作中提到】
: 具我所知，几个fish labs正在联合用ZFN搞大规模的knock out resources。ZFN以及相
: 关技术最近会有比较大的进展。大家如果感兴趣，可以关注一下最近的TALEN技术。在
: 最近1-2年内，估计任何试验室都可以自己合成reagent去target任何基因。cost不会比
: 买限制性内切酶高太多。
:
: model
: transpare
: rep
: to
: 很多
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p*******r
发帖数: 4048 | 95 但是 fish靠谱的behavior不多， 现在也就主要有人搞点motor behavior.
【在 G*****m 的大作中提到】
: 因为个儿小，做neural circuit很有优势，能比较容易看到整个功能区的细胞活动，不
: 像老鼠只见树木不见森林。
:
: model
: transpare
: rep
: to
: 很多
: serious的
: 大好
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s******y
发帖数: 28562 | 96 能看到什么样的分辨率和深度？
可以看到荧光么？
【在 p*******r 的大作中提到】
: 我最近在研究全老鼠的imaging...
: 技术上最近还是颇有些新方法的， 我觉得以后看个胚胎应该是可以的。
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D*a
发帖数: 6830 | 97 胚胎不是在老鼠肚子里么？
【在 p*******r 的大作中提到】
: 我最近在研究全老鼠的imaging...
: 技术上最近还是颇有些新方法的， 我觉得以后看个胚胎应该是可以的。
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D*a
发帖数: 6830 | 98 这个理论上是confidential吧，还是删了吧。
【在 X******n 的大作中提到】
: 我好像看到老板在审一篇用ＺＦＮ做Ｋｎｏｃｋｉｎ的文章，发到Ｎａｔｕｒｅ上的。
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p*****m
发帖数: 7030 | 99 最近很有几篇TALEN的应用 看起来效率至少不比ZFN差啊 programability更是远胜
【在 p*******r 的大作中提到】
: TALE 其实还暂时没那么好。
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p*****m
发帖数: 7030 | 100 这个我觉得是搞的人不多 而不是靠谱的行为不多
【在 p*******r 的大作中提到】
: 但是 fish靠谱的behavior不多， 现在也就主要有人搞点motor behavior.
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w**********s
发帖数: 72 | 101 How about stem cell research in fish? Isn't that part of the developmental
biology?
【在 M*****n 的大作中提到】
: 俺昨天不是说了，next big thing 就是knockout fish. 你应该朝这个方向努力。如果
: 你把这个做出来，虽然得不了炸药将，但是名气也不会小了。
: developmental biology is pretty much over. don't waster your time on it.
: pushing/shaking flies is good for beginners to learn genetics.
: my 2 cents.
:
: model
: transpare
: rep
: to
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p*******r
发帖数: 4048 | 102 哦， 似乎off target要多一点。
【在 p*****m 的大作中提到】
: 最近很有几篇TALEN的应用 看起来效率至少不比ZFN差啊 programability更是远胜
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A****A
发帖数: 16 | 103 实际上，目前大部分证据表明TALEN的off target效应要小于ZFN. TALEN现在的主要缺
点在于size太大，一个TALEN coding sequecne 至少要4kb, 而ZFN则只要1kb左右。而
且从目前以发表的和我们自己的数据来看，TALEN的剪切活性可能要低于ZFN。现在一些
实验室都在进一步优化TALEN的size以及活性，希望以后能有大幅度的提高。TALEN相对
于ZFN目前最大的优势是位点的选择范围更大。基本上每5-10bp就可以找到一个好的
TALEN位点。ZFN目前是200bp-500bp. 另外TALEN的出现打破了ZFN在genome
engineering领域的垄断地位。将大大降低reagent的价格。现在法国的Cellectis就提
供$5000TALEN的订制服务。Sigma的ZFN价格也会跟着降下来。
【在 p*******r 的大作中提到】
: 哦， 似乎off target要多一点。
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u**********d
发帖数: 573 | 104 talen一定要那么多的手指吗？手指多了off target会不会反而多啊？
【在 A****A 的大作中提到】
: 实际上，目前大部分证据表明TALEN的off target效应要小于ZFN. TALEN现在的主要缺
: 点在于size太大，一个TALEN coding sequecne 至少要4kb, 而ZFN则只要1kb左右。而
: 且从目前以发表的和我们自己的数据来看，TALEN的剪切活性可能要低于ZFN。现在一些
: 实验室都在进一步优化TALEN的size以及活性，希望以后能有大幅度的提高。TALEN相对
: 于ZFN目前最大的优势是位点的选择范围更大。基本上每5-10bp就可以找到一个好的
: TALEN位点。ZFN目前是200bp-500bp. 另外TALEN的出现打破了ZFN在genome
: engineering领域的垄断地位。将大大降低reagent的价格。现在法国的Cellectis就提
: 供$5000TALEN的订制服务。Sigma的ZFN价格也会跟着降下来。
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k****o
发帖数: 589 | 105 目前各大pharma用in vitro和cell-based的平台都筛不出好的candidate molecule。这
样的形势下，用鱼做screen到底有多大意义？ |
