A***g
发帖数: 191 | 1 最近在做western，不想用湿转，可是这个半干转效率也太差了呀，用的是Biorad的
Precision plus双色的预染marker，结果怎样延长时间（15v 22min 或者10v 36 min,
protocol是建议15v 15min or 10v 30min的）， 那个75kd以上的基本上都还留在胶上
，没能转到膜上。目的条带说是在76KD的，这样的转膜效率让我怎么往下做啊。
我用的是PVDF膜。
恳请赐教啊，转膜buffer, 滤纸 有什么要注意的吗 |
D******U
发帖数: 385 | 2 还是miniblot湿转吧
着急的话40-50v/gel 冷室加冰 20%甲醇 2-3hrs
250-5kd转的刚刚的
Nitrocellulose膜好点 就是杂交时不禁造
WB这玩意 这么多年 各种新设备都试了 还是老办法效率最好 |
i**********a
发帖数: 1402 | 3 一般是15v一个小时，不要用他们建议的，20v一个小时也行 |
q*****n
发帖数: 331 | 4 Did you pre-sock and activate your PVDF with Methanol?
Check your transfer buffers? Were they made correctly?
We use:
25 mA per membrane and maximum voltage set at 35V for 0.5 hour.
It transferred really well. |
p*3
发帖数: 45 | 5 我一般是40mA 每块胶 三小时，或者10mA每块脚过夜的。如果蛋白小于20kd就稍微缩短。
做过几百回，没问题的。 |
J******r
发帖数: 2806 | 6 我觉得以上说的有道理，同时提醒一下：
check the PI of your protein
因为buffer的ph是一定的，所以半干的buffer不试用于所有的protein |
B******o
发帖数: 496 | 7 你说的Semi-Dry? 效率挺高的啊。
俺一般0.18A constant for 35min。基本上marker都转过去，偶尔有一丝还留在gel里
buffer就是普通的transfer buffer+甲醇. 滤纸用的也是biorad的8x13.5cm那种
,
【在 A***g 的大作中提到】
: 最近在做western，不想用湿转，可是这个半干转效率也太差了呀，用的是Biorad的
: Precision plus双色的预染marker，结果怎样延长时间（15v 22min 或者10v 36 min,
: protocol是建议15v 15min or 10v 30min的）， 那个75kd以上的基本上都还留在胶上
: ，没能转到膜上。目的条带说是在76KD的，这样的转膜效率让我怎么往下做啊。
: 我用的是PVDF膜。
: 恳请赐教啊，转膜buffer, 滤纸 有什么要注意的吗
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s*****v
发帖数: 274 | 8 有米的上iBlot，tmd的真快。
【在 D******U 的大作中提到】
: 还是miniblot湿转吧
: 着急的话40-50v/gel 冷室加冰 20%甲醇 2-3hrs
: 250-5kd转的刚刚的
: Nitrocellulose膜好点 就是杂交时不禁造
: WB这玩意 这么多年 各种新设备都试了 还是老办法效率最好
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O******e
发帖数: 4845 | 9 效果如何？
【在 s*****v 的大作中提到】
: 有米的上iBlot，tmd的真快。
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A***g
发帖数: 191 | 10 我的蛋白就是抽提的不同human cell line的核蛋白，不是什么特定的蛋白。不过可能
buffer会有问题。
【在 J******r 的大作中提到】
: 我觉得以上说的有道理，同时提醒一下：
: check the PI of your protein
: 因为buffer的ph是一定的，所以半干的buffer不试用于所有的protein
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A***g
发帖数: 191 | 11 Yes, I activated my PVDF with Methanol for 5 min.
I will try to set up 25 MA next time.
For voltage, since the protocol said: Do not exceed 25 volts, so I never try
higher voltage.
【在 q*****n 的大作中提到】
: Did you pre-sock and activate your PVDF with Methanol?
: Check your transfer buffers? Were they made correctly?
: We use:
: 25 mA per membrane and maximum voltage set at 35V for 0.5 hour.
: It transferred really well.
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A***g
发帖数: 191 | 12 下次会延长时间。
我一般也就是设定电压，但发现转膜过程中，电流会逐渐降低，会降到很低，就以为时
间延长没有什么用。
还有，再请教下，跟滤纸会不会也有关系呢，我用了Biorad的Extra thick blot paper
滤纸。
【在 i**********a 的大作中提到】
: 一般是15v一个小时，不要用他们建议的，20v一个小时也行
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d*********y
发帖数: 473 | 13 是不是transfer buffer干掉了？
paper
【在 A***g 的大作中提到】
: 下次会延长时间。
: 我一般也就是设定电压，但发现转膜过程中，电流会逐渐降低，会降到很低，就以为时
: 间延长没有什么用。
: 还有，再请教下，跟滤纸会不会也有关系呢，我用了Biorad的Extra thick blot paper
: 滤纸。
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c**********e
发帖数: 230 | 14 semi dry的话, 应该是constant current
wet transfer才应该是恒压的 |
Z******5
发帖数: 435 | 15 100mA 一个小时，50kD以下都没问题。 75kD的可以考虑延长到一个半小时。 |
s****u
发帖数: 483 | 16 i compared the result side by side for a 300kd protein transfer.
traditional wet transfer 1hr vs. iblot 7+1 additional minutes
conclusion: traditional way beat iblot by at least 5 fold.
【在 s*****v 的大作中提到】
: 有米的上iBlot，tmd的真快。
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A*******e
发帖数: 284 | 17 你用的是什么transfer buffer阿， 我一般20V 18MIN，都转的干干净净的，这一步从
来没有出过问题。标准的mini gel，刚开始的时候电流达到300mA 以上吧， 然后逐渐
下降。PVDF膜我一般甲醇里面过一下然后水洗 再在buffer里面泡， 滤纸胶也一起泡
泡几分钟看心情，然后就转了 |
a***c
发帖数: 960 | 18 我也有楼主说的问题，是不是buffer有问题呢？
我用的是Towbin buffer（25 mM Tris, 192 mM glycine (20% methanol)），Bio-Rad
的机器，测了buffer的pH8.5，似乎没有问题。
你的buffer配方是什么？
【在 A*******e 的大作中提到】
: 你用的是什么transfer buffer阿， 我一般20V 18MIN，都转的干干净净的，这一步从
: 来没有出过问题。标准的mini gel，刚开始的时候电流达到300mA 以上吧， 然后逐渐
: 下降。PVDF膜我一般甲醇里面过一下然后水洗 再在buffer里面泡， 滤纸胶也一起泡
: 泡几分钟看心情，然后就转了
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a***c
发帖数: 960 | |
