t****g
发帖数: 120 | 1 我最近一直在做一个gene的knockdown cell line。 用的是open biosystems的pLKO.1
system。 try了三个不同的cell lines，发现一个普遍问题： 细胞养了一个月之后我
就不同程度地丢失了最开始的knockdown. 我会详细解释一下我的做法，请大家帮我看
看问题到底在哪儿：
day 1: plate cancer cells for transduction
day 2: add virus/polybrene to cells (half volume of media) in the morning;
6hr later, add the other half volume of media to dilute polybrene
day 4: change to selection medium
day 5: in my case, usually the cells have become confluent before the effect
of antibiotics became obvious. I had to split the cells. If I expand the
cells in selection medium, too much cell death. so I usually expand the
cells in normal medium (without antibiotics) and change to selection medium
first thing on the next morning.
day 6-12: keep changing with fresh selection medium on a daily base. when
cells became stable, collect RNA for real time RT-PCR.
keep maintaining cells in selection medium. for the first 2-3 weeks, still
split cells in normal medium and change to selection medium first thing the
next morning.
一般我会用5个shRNA来test。 可奇怪的是，我从来得不到非常高的knockdown
efficiency，最多也就是60% off。 经常看别人的paper图上显示70%, 80%off,真是羡
慕的我啊！ 因为我总担心knockdown efficiency不高就看不到什么phenotype.
而且即使是这么不高的knockdown，也会随着时间而消逝： selection一个星期之后的
60% off三个星期之后变成40%-30% off, 甚至完全消失，target gene又回到normal
level.
我是害怕和vector cells有cross contamination，所以分细胞的时候很注意换pipette
什么的。 请教各位到底会是什么原因呢？ |
s******a
发帖数: 472 | 2 Knockdown of the gene confers survival disadvantage? |
C***Y
发帖数: 61 | 3
1
effect
the
It is common issue with shRNA knockdown, so do not get frustrated. If you
can get enough cells for downstream experiments at day 5 or 6, just harvest
cells at that time point, otherwise, I suggest you use inducible knockdown.
【在 t****g 的大作中提到】
: 我最近一直在做一个gene的knockdown cell line。 用的是open biosystems的pLKO.1
: system。 try了三个不同的cell lines，发现一个普遍问题： 细胞养了一个月之后我
: 就不同程度地丢失了最开始的knockdown. 我会详细解释一下我的做法，请大家帮我看
: 看问题到底在哪儿：
: day 1: plate cancer cells for transduction
: day 2: add virus/polybrene to cells (half volume of media) in the morning;
: 6hr later, add the other half volume of media to dilute polybrene
: day 4: change to selection medium
: day 5: in my case, usually the cells have become confluent before the effect
: of antibiotics became obvious. I had to split the cells. If I expand the
|
t****g
发帖数: 120 | 4 谢谢回复！
我开始也以为是影响survival，还挺高兴，以为发现了这个gene的一个作用，可在
knockdown的细胞里，也没发现有increased apoptosis。
原来这是个common issue吗？ 我做knockdown的细胞的一个主要目的是收RNA做
microarray，好看看这个gene影响到哪些genes/pathway。 为严谨起见，我从不同的
passage收RNA，而不是一个passage好几个盘子。 可因为这种loss of knockdown最后
我都收的RNA都不能用了。
如果用inducible knockdown的话，用多长的time window为好呢？ 3天？ 一个星期？
还是各有利弊只能做做看？ |
j******1
发帖数: 1315 | 5 理论上应该挑单克隆的细胞 3-4个，鉴定后再mix在一起。当然，大家都是能用就好了
，很少有人真这么做。 |
q******g
发帖数: 3858 | 6 我们用pLKO.1也有同样的问题。一般都是在split cell后一天，才加入puromycin. 一
般经过3-4天，没有感染的细胞（negative control）会全部死去。这个时候，你可以
冷冻一些细胞，用于以后的实验。而经过删选的细胞用过2-3周，就不用了。使用冷冻
的。
knockdown efficiency我的基因也只有60%左右。我觉得这个和shRNA的设计有关。当然
，很多公司会重新给你设计或者退款，如果达不到80%。 |
C***Y
发帖数: 61 | 7 I usually add puromycin to cells 36 hrs after transduction,
and harvest cells for RNA 72 hrs after adding puromycin. You should be able
to get enough cells for microarray this way. Actually, I am testing inducible systems now,
and the problem I having now is leakage.
？
【在 t****g 的大作中提到】
: 谢谢回复！
: 我开始也以为是影响survival，还挺高兴，以为发现了这个gene的一个作用，可在
: knockdown的细胞里，也没发现有increased apoptosis。
: 原来这是个common issue吗？ 我做knockdown的细胞的一个主要目的是收RNA做
: microarray，好看看这个gene影响到哪些genes/pathway。 为严谨起见，我从不同的
: passage收RNA，而不是一个passage好几个盘子。 可因为这种loss of knockdown最后
: 我都收的RNA都不能用了。
: 如果用inducible knockdown的话，用多长的time window为好呢？ 3天？ 一个星期？
: 还是各有利弊只能做做看？
|
B******o
发帖数: 496 | 8 你的目的是什么呢？什么细胞呢？如果只是收RNA做array，完全不需要筛stable line
啊。直接做virus infection就好。pLKO无论是virus的生产量还是KD的效率都很高的
1
effect
the
【在 t****g 的大作中提到】
: 我最近一直在做一个gene的knockdown cell line。 用的是open biosystems的pLKO.1
: system。 try了三个不同的cell lines，发现一个普遍问题： 细胞养了一个月之后我
: 就不同程度地丢失了最开始的knockdown. 我会详细解释一下我的做法，请大家帮我看
: 看问题到底在哪儿：
: day 1: plate cancer cells for transduction
: day 2: add virus/polybrene to cells (half volume of media) in the morning;
: 6hr later, add the other half volume of media to dilute polybrene
: day 4: change to selection medium
: day 5: in my case, usually the cells have become confluent before the effect
: of antibiotics became obvious. I had to split the cells. If I expand the
|
t****g
发帖数: 120 | 9 请问直接做virus infection是什么意思？ 给细胞加上virus，三天后收RNA吗？
我还想做些functional assay，比如proliferation assay, apoptosis assay, 所以想
着如果有stable cell lines会比较方便些。 |
B******o
发帖数: 496 | 10 pLKO.1本身就是lentiviral vector. 你用它在293细胞内生产lentivirus。然后用
virus直接infect你的目标细胞。感染后，vector大概需要2-3天开始表达你的shRNA，
你再等个2-3天就可以看knockdown的效率了。生产virus的时候你需要co-transfect
virus packaging vector。 SBI的那套效率不错。Addgene上也有类似的，具体的条件
得自己摸一下。
pLKO如果只是做transfection的时候KD效率不咋的。但用virus去KD基因的话，5个
shRNA至少有2个都能超过70%。
infect过的细胞因为virus是整合在基因组上的，可以养很长时间，即使不加药筛
选。
【在 t****g 的大作中提到】
: 请问直接做virus infection是什么意思？ 给细胞加上virus，三天后收RNA吗？
: 我还想做些functional assay，比如proliferation assay, apoptosis assay, 所以想
: 着如果有stable cell lines会比较方便些。
|
b**********8
发帖数: 349 | 11 解释的很对很详细。
【在 B******o 的大作中提到】
: pLKO.1本身就是lentiviral vector. 你用它在293细胞内生产lentivirus。然后用
: virus直接infect你的目标细胞。感染后，vector大概需要2-3天开始表达你的shRNA，
: 你再等个2-3天就可以看knockdown的效率了。生产virus的时候你需要co-transfect
: virus packaging vector。 SBI的那套效率不错。Addgene上也有类似的，具体的条件
: 得自己摸一下。
: pLKO如果只是做transfection的时候KD效率不咋的。但用virus去KD基因的话，5个
: shRNA至少有2个都能超过70%。
: infect过的细胞因为virus是整合在基因组上的，可以养很长时间，即使不加药筛
: 选。
|
L*****o
发帖数: 48 | 12 sorry to referring this topic to ask a shRNA related question. When doing
shRNA transfection (lentiviral vector), do you need to starve the cells
using conditional medium? |
