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Biology版 - 请ChIP专家帮我看看sonicating的问题
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chip实验求教:大家用0.5%的SDS还是用1%的SDSCHIP qpcr中的 negative control (mock antibody)
什么东西可以替代SONICATOR呢?Re: 超声波裂解E.coli细胞求救!
CO IP的一些问题! 大神们进呀!Re: crucial problems in Chromatin IP? HELP!!
请教大家是怎么去除protein里混含的genomic DNA的?紧急求助, Chip sample shear得不够,可以在dilution buffer里补么?
好心人贴个E. coli的lysis buffer的recipe吧刚刚试做ChIP,请专家帮忙看看问题
help: crosslink co-immunoprecipitation大侠们做chip是用sonicator还是用MNase digest?
Question again, protein expression/rossetta gami/inclusion body/cell lysisNeed help: Troubleshooting--Western blotting for NHE(Na+/H+ exchanger)5-9.
相关话题的讨论汇总
话题: buffer话题: dna话题: lysis话题: sonicating话题: sonication
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1 (共1页)
n******2
发帖数: 971
1
图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片
断,而且小片段富集也不明显。是什么原因?
s******s
发帖数: 13035
2
做到36再看吧
btw, marker连size都不标

【在 n******2 的大作中提到】
: 图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片
: 断,而且小片段富集也不明显。是什么原因?

n******2
发帖数: 971
3
加了size.

【在 n******2 的大作中提到】
: 图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片
: 断,而且小片段富集也不明显。是什么原因?

s******s
发帖数: 13035
4
大小差不多啊。18已经有点不错的趋势啦,再接再厉,你还远远不够
不要参考别人paper上的cycle, 机器设置可能差很多的。

【在 n******2 的大作中提到】
: 加了size.
s******s
发帖数: 13035
5
btw, 你可以试一下MNase,感觉这个干净很多

【在 s******s 的大作中提到】
: 大小差不多啊。18已经有点不错的趋势啦,再接再厉,你还远远不够
: 不要参考别人paper上的cycle, 机器设置可能差很多的。

j****t
发帖数: 1663
6
Sonicator的功率是否够强?
SDS加得够吗?
可以试一下这个lysis buffer:
Lysis Buffer:
Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,
0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease
inhibitors
建议follow几个nature protocol 的文章试试!
w********r
发帖数: 1431
7
要把DNA上的蛋白弄掉再跑胶。
否则DNA上面结合着蛋白size没法看
C***Y
发帖数: 61
8

This buffer look good to me. Use this buffer to figure out the best
condition with your sonicator.

【在 j****t 的大作中提到】
: Sonicator的功率是否够强?
: SDS加得够吗?
: 可以试一下这个lysis buffer:
: Lysis Buffer:
: Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,
: 0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease
: inhibitors
: 建议follow几个nature protocol 的文章试试!

g*******f
发帖数: 427
9
我估计你是sonication 后直接拿来跑胶的。你得完全按照ChIP的样品处理方法reverse
crosslink 后用 phenol chloroform 纯化DNA 后再跑胶,你就会看到富集的小片段了
,而不是smear
n******2
发帖数: 971
10
Thanks a lot for the suggestions.
However, the DNA samples shown here were already after the step of reverse-
cross linking.
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好心人贴个E. coli的lysis buffer的recipe吧求助---关于nuclear protein
help: crosslink co-immunoprecipitationCHIP qpcr中的 negative control (mock antibody)
Question again, protein expression/rossetta gami/inclusion body/cell lysisRe: 超声波裂解E.coli细胞求救!
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n******2
发帖数: 971
11
output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily.
final concentration of SDS is 0.8%.

【在 j****t 的大作中提到】
: Sonicator的功率是否够强?
: SDS加得够吗?
: 可以试一下这个lysis buffer:
: Lysis Buffer:
: Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,
: 0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease
: inhibitors
: 建议follow几个nature protocol 的文章试试!

n******2
发帖数: 971
12
Do you sonicate the cells in Lysis buffer?

【在 j****t 的大作中提到】
: Sonicator的功率是否够强?
: SDS加得够吗?
: 可以试一下这个lysis buffer:
: Lysis Buffer:
: Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,
: 0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease
: inhibitors
: 建议follow几个nature protocol 的文章试试!

s******s
发帖数: 13035
13
你直接在lysis buffer里面sonicate的?我们都是在TE+EGTA里面,
不是很容易起bubble

【在 n******2 的大作中提到】
: output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily.
: final concentration of SDS is 0.8%.

n******2
发帖数: 971
14
No, my sonicating buffer is slightly different from lysis buffer.
They both contain low concentration of Tris, NaCl, MgCl2, CaCl2, however,
sonicating buffer consists of higher amount of IGEPAL4% (compare to 0.5% in
lysis B) and 0.8% SDS.
I'm following the protocol developed by Affymatrix. It worked well on mouse
cells performed by another lab, but bothers me very much on my human cell
line.

【在 s******s 的大作中提到】
: 你直接在lysis buffer里面sonicate的?我们都是在TE+EGTA里面,
: 不是很容易起bubble

j****t
发帖数: 1663
15
我的sonication 步骤如下,具体输出功率不详(可以参考Branson的说明书)。0.8%
SDS 应该足够强了.我用的是0.1% of Na-deoxycholate and 0.2% of sarkosyl (以前
用过0.5% of sarkosyl)。我有时候看lysate是否clear了,来决定sonication的次数。
Sonicate sample (in a 15 ml falcon tube) using Branson 450 sonicator (Power
Set 2 or 4, duty cycle 100%, 4-6 times, 30 sec each with 1 min interval).
During the sonication, keep falcon tube in a 50 ml beaker filled with ice.

【在 n******2 的大作中提到】
: output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily.
: final concentration of SDS is 0.8%.

j****t
发帖数: 1663
16
我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl(instead of 0.
5%),和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent
对于IP 来说还是高了些,我会在做IP前把sample稀释一倍。
我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了,问题说不定是在reverse-
crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下,供你参考参考。
Check chromatin size and conc.
1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M
NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR
tube).
2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) to reverse
crosslink.
3. Add 2 ul of 10 mg/ml RNase A (Sigma #R6513), incubate at 37 oC for
30min- 1hr.
4. Purify DNA using Qiagen PCR purification column (or phenol/cholorform
purification method). Use 20 ul EB to elute DNA. Measure conc. using
Nanodrop or Invitrogen Qubit™ Fluorometer. Load the rest of DNA into
the 1 % agarose gel. The chromatin should be a smear around 500 bp (using
the loading dye containing only xylene blue).

【在 n******2 的大作中提到】
: Do you sonicate the cells in Lysis buffer?
k*****n
发帖数: 323
17
你可以试试rick young的protocol的buffer,然后18min做chip-chip足够了,如果你
要做seq,需要再sonicate,保持样品在冰上~
k*****n
发帖数: 323
18
还有一个,可以考虑稀释一下样品在做sonication,问一下你们sonicate用的什么机器
s******s
发帖数: 13035
19
我们sonicate的buffer里面没有任何detergent,就是plain的Tris EDTA EGTA,
应该是Ren Bing的protocol

0.
detegent
M

【在 j****t 的大作中提到】
: 我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl(instead of 0.
: 5%),和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent
: 对于IP 来说还是高了些,我会在做IP前把sample稀释一倍。
: 我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了,问题说不定是在reverse-
: crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下,供你参考参考。
: Check chromatin size and conc.
: 1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M
: NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR
: tube).
: 2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) to reverse

1 (共1页)
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请做Chip-seq的大侠 看下size,好心人贴个E. coli的lysis buffer的recipe吧
哪家的ChiP kit最好用?谢谢。help: crosslink co-immunoprecipitation
ChIP之前有没有其他代替sonication的方法去 shear chromatin?Question again, protein expression/rossetta gami/inclusion body/cell lysis
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