n******2 发帖数: 971 | 1 图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片
断,而且小片段富集也不明显。是什么原因? |
s******s 发帖数: 13035 | 2 做到36再看吧
btw, marker连size都不标
【在 n******2 的大作中提到】 : 图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片 : 断,而且小片段富集也不明显。是什么原因?
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n******2 发帖数: 971 | 3 加了size.
【在 n******2 的大作中提到】 : 图片从左到右依次是0、3、6、9、12、15、18 sonicating cycles。始终有大的DNA片 : 断,而且小片段富集也不明显。是什么原因?
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s******s 发帖数: 13035 | 4 大小差不多啊。18已经有点不错的趋势啦,再接再厉,你还远远不够
不要参考别人paper上的cycle, 机器设置可能差很多的。
【在 n******2 的大作中提到】 : 加了size.
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s******s 发帖数: 13035 | 5 btw, 你可以试一下MNase,感觉这个干净很多
【在 s******s 的大作中提到】 : 大小差不多啊。18已经有点不错的趋势啦,再接再厉,你还远远不够 : 不要参考别人paper上的cycle, 机器设置可能差很多的。
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j****t 发帖数: 1663 | 6 Sonicator的功率是否够强?
SDS加得够吗?
可以试一下这个lysis buffer:
Lysis Buffer:
Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA,
0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease
inhibitors
建议follow几个nature protocol 的文章试试! |
w********r 发帖数: 1431 | 7 要把DNA上的蛋白弄掉再跑胶。
否则DNA上面结合着蛋白size没法看 |
C***Y 发帖数: 61 | 8
This buffer look good to me. Use this buffer to figure out the best
condition with your sonicator.
【在 j****t 的大作中提到】 : Sonicator的功率是否够强? : SDS加得够吗? : 可以试一下这个lysis buffer: : Lysis Buffer: : Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, : 0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease : inhibitors : 建议follow几个nature protocol 的文章试试!
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g*******f 发帖数: 427 | 9 我估计你是sonication 后直接拿来跑胶的。你得完全按照ChIP的样品处理方法reverse
crosslink 后用 phenol chloroform 纯化DNA 后再跑胶,你就会看到富集的小片段了
,而不是smear |
n******2 发帖数: 971 | 10 Thanks a lot for the suggestions.
However, the DNA samples shown here were already after the step of reverse-
cross linking. |
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n******2 发帖数: 971 | 11 output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily.
final concentration of SDS is 0.8%.
【在 j****t 的大作中提到】 : Sonicator的功率是否够强? : SDS加得够吗? : 可以试一下这个lysis buffer: : Lysis Buffer: : Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, : 0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease : inhibitors : 建议follow几个nature protocol 的文章试试!
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n******2 发帖数: 971 | 12 Do you sonicate the cells in Lysis buffer?
【在 j****t 的大作中提到】 : Sonicator的功率是否够强? : SDS加得够吗? : 可以试一下这个lysis buffer: : Lysis Buffer: : Consists of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, : 0.5 mM EGTA, 0.1% Na-Deoxycholate, 0.5% N-lauroylsarcosine, 1× protease : inhibitors : 建议follow几个nature protocol 的文章试试!
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s******s 发帖数: 13035 | 13 你直接在lysis buffer里面sonicate的?我们都是在TE+EGTA里面,
不是很容易起bubble
【在 n******2 的大作中提到】 : output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily. : final concentration of SDS is 0.8%.
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n******2 发帖数: 971 | 14 No, my sonicating buffer is slightly different from lysis buffer.
They both contain low concentration of Tris, NaCl, MgCl2, CaCl2, however,
sonicating buffer consists of higher amount of IGEPAL4% (compare to 0.5% in
lysis B) and 0.8% SDS.
I'm following the protocol developed by Affymatrix. It worked well on mouse
cells performed by another lab, but bothers me very much on my human cell
line.
【在 s******s 的大作中提到】 : 你直接在lysis buffer里面sonicate的?我们都是在TE+EGTA里面, : 不是很容易起bubble
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j****t 发帖数: 1663 | 15 我的sonication 步骤如下,具体输出功率不详(可以参考Branson的说明书)。0.8%
SDS 应该足够强了.我用的是0.1% of Na-deoxycholate and 0.2% of sarkosyl (以前
用过0.5% of sarkosyl)。我有时候看lysate是否clear了,来决定sonication的次数。
Sonicate sample (in a 15 ml falcon tube) using Branson 450 sonicator (Power
Set 2 or 4, duty cycle 100%, 4-6 times, 30 sec each with 1 min interval).
During the sonication, keep falcon tube in a 50 ml beaker filled with ice.
【在 n******2 的大作中提到】 : output is 5-6 watt. Can't go higher since it will produce bubbles easily. : final concentration of SDS is 0.8%.
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j****t 发帖数: 1663 | 16 我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl(instead of 0.
5%),和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent
对于IP 来说还是高了些,我会在做IP前把sample稀释一倍。
我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了,问题说不定是在reverse-
crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下,供你参考参考。
Check chromatin size and conc.
1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M
NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR
tube).
2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) to reverse
crosslink.
3. Add 2 ul of 10 mg/ml RNase A (Sigma #R6513), incubate at 37 oC for
30min- 1hr.
4. Purify DNA using Qiagen PCR purification column (or phenol/cholorform
purification method). Use 20 ul EB to elute DNA. Measure conc. using
Nanodrop or Invitrogen Qubit™ Fluorometer. Load the rest of DNA into
the 1 % agarose gel. The chromatin should be a smear around 500 bp (using
the loading dye containing only xylene blue).
【在 n******2 的大作中提到】 : Do you sonicate the cells in Lysis buffer?
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k*****n 发帖数: 323 | 17 你可以试试rick young的protocol的buffer,然后18min做chip-chip足够了,如果你
要做seq,需要再sonicate,保持样品在冰上~ |
k*****n 发帖数: 323 | 18 还有一个,可以考虑稀释一下样品在做sonication,问一下你们sonicate用的什么机器
? |
s******s 发帖数: 13035 | 19 我们sonicate的buffer里面没有任何detergent,就是plain的Tris EDTA EGTA,
应该是Ren Bing的protocol
0.
detegent
M
【在 j****t 的大作中提到】 : 我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl(instead of 0. : 5%),和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent : 对于IP 来说还是高了些,我会在做IP前把sample稀释一倍。 : 我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了,问题说不定是在reverse- : crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下,供你参考参考。 : Check chromatin size and conc. : 1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M : NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR : tube). : 2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) to reverse
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