F*****d
发帖数: 23 | |
s****l
发帖数: 10462 | 2 Life Tech & Illumina股票重创啊
不过我脚得是第二个PacBio |
s******a
发帖数: 472 | |
s******s
发帖数: 13035 | |
i*e
发帖数: 352 | |
s****l
发帖数: 10462 | 6 Too good to be true ah! 要是真的话，这个公司不止值$1B
很奇怪还有大半年（这么有力的）原型才能出来，现在就着急在AGBT上展示。 |
w******n
发帖数: 767 | |
p******n
发帖数: 874 | 8 4% error rate, even 1% is kind of high |
y******8
发帖数: 1764 | 9 Best technology so far.
4% error rate is damn good for a single molecule seq tech, if you compare it
with 30% rate of the PacBio's SMRT tech. If you have 10x coverages,then the
overall error rate should be near to zero.
The through-put would not be a problem, because a single pore can handle
multiple strands sequentially.
Life tech should be concerned, very concerned. |
w******n
发帖数: 767 | 10 是不是测出来人和猩猩没区别。
【在 p******n 的大作中提到】
: 4% error rate, even 1% is kind of high
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m***T
发帖数: 11058 | 11 听着是挺promising的，看产品和data吧 |
y******8
发帖数: 1764 | 12 我等着Ion Proton降价。
【在 m***T 的大作中提到】
: 听着是挺promising的，看产品和data吧
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m***T
发帖数: 11058 | 13 It's too early to tell at this moment. We will have to see how good the
data quality is and what the throughput will be. Not their internal data
but from early access customers using real samples.
If nanopore is not a real contender, I don't see why Proton will drop
price right after launch.
【在 y******8 的大作中提到】
: 我等着Ion Proton降价。
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y******8
发帖数: 1764 | 14 Ion刚出的时候，我觉得HiSeq会在5年内被取代。
现在Nanopore出来了，Ion如果没有本质的突破，将会和HiSeq同时同命运。
与Nanopore比，Ion的速度处于劣势，读长劣势。
如果是比较raw error的话，Ion也没有优势可言。算法校正上，我对life没有太大的信
心。
最后比较通量，如果Nanopore的膜形状不是平面，而是多曲面，体积不便，这个通量增
加的办法可比Ion downsize well容易多了。
如果Ion不需要bead和emPCR了，估计还有一拼。
【在 m***T 的大作中提到】
: It's too early to tell at this moment. We will have to see how good the
: data quality is and what the throughput will be. Not their internal data
: but from early access customers using real samples.
: If nanopore is not a real contender, I don't see why Proton will drop
: price right after launch.
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s******s
发帖数: 13035 | 15 这都是假设nanopore能够按照预想的速度推出，升级。。。
ion还号称每半年升四倍呢，这个你怎么不考虑？
pacbio还单分子呢，不能deliver还是白吹
【在 y******8 的大作中提到】
: Ion刚出的时候，我觉得HiSeq会在5年内被取代。
: 现在Nanopore出来了，Ion如果没有本质的突破，将会和HiSeq同时同命运。
: 与Nanopore比，Ion的速度处于劣势，读长劣势。
: 如果是比较raw error的话，Ion也没有优势可言。算法校正上，我对life没有太大的信
: 心。
: 最后比较通量，如果Nanopore的膜形状不是平面，而是多曲面，体积不便，这个通量增
: 加的办法可比Ion downsize well容易多了。
: 如果Ion不需要bead和emPCR了，估计还有一拼。
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y******8
发帖数: 1764 | 16 pacbio的单分子相互必须有一定的距离，这严重限制了通量。第二，它的chemistry有
很大的缺陷，造成raw error 1/3.
ion做到了每半年升四倍。不过以后它基本上就downsize bead这一招，downsize 一半
，通量就升四倍。
Nanopore可以改进的地方太多了，我还没法算出其通量的上限。原则上，DNA上样浓度
可以远远大于其他办法，不受单克隆限制。
技术上，Nanopore没理由不会四年后远超Ion
【在 s******s 的大作中提到】
: 这都是假设nanopore能够按照预想的速度推出，升级。。。
: ion还号称每半年升四倍呢，这个你怎么不考虑？
: pacbio还单分子呢，不能deliver还是白吹
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s******s
发帖数: 13035 | 17 这种理论上的都是臆测。说不定下半年另一家公司或者类似pore的出来就把它
打倒了。
【在 y******8 的大作中提到】
: pacbio的单分子相互必须有一定的距离，这严重限制了通量。第二，它的chemistry有
: 很大的缺陷，造成raw error 1/3.
: ion做到了每半年升四倍。不过以后它基本上就downsize bead这一招，downsize 一半
: ，通量就升四倍。
: Nanopore可以改进的地方太多了，我还没法算出其通量的上限。原则上，DNA上样浓度
: 可以远远大于其他办法，不受单克隆限制。
: 技术上，Nanopore没理由不会四年后远超Ion
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y******8
发帖数: 1764 | 18 then, even better, right?
【在 s******s 的大作中提到】
: 这种理论上的都是臆测。说不定下半年另一家公司或者类似pore的出来就把它
: 打倒了。
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s****l
发帖数: 10462 | 19 NP 一个数据都没有，就想到四年之后未免太高瞻远瞩了。
【在 y******8 的大作中提到】
: pacbio的单分子相互必须有一定的距离，这严重限制了通量。第二，它的chemistry有
: 很大的缺陷，造成raw error 1/3.
: ion做到了每半年升四倍。不过以后它基本上就downsize bead这一招，downsize 一半
: ，通量就升四倍。
: Nanopore可以改进的地方太多了，我还没法算出其通量的上限。原则上，DNA上样浓度
: 可以远远大于其他办法，不受单克隆限制。
: 技术上，Nanopore没理由不会四年后远超Ion
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t*d
发帖数: 1290 | 20 Ion 的bead现在多大？downsize 的极限在哪？
【在 y******8 的大作中提到】
: pacbio的单分子相互必须有一定的距离，这严重限制了通量。第二，它的chemistry有
: 很大的缺陷，造成raw error 1/3.
: ion做到了每半年升四倍。不过以后它基本上就downsize bead这一招，downsize 一半
: ，通量就升四倍。
: Nanopore可以改进的地方太多了，我还没法算出其通量的上限。原则上，DNA上样浓度
: 可以远远大于其他办法，不受单克隆限制。
: 技术上，Nanopore没理由不会四年后远超Ion
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t*d
发帖数: 1290 | 21 有些时候还是可以想象一下的。而且有些时候需要想象一下。对于有些人来说，未来几
年年 NGS 的发展空间，直接影响自己的职业规划。
【在 s****l 的大作中提到】
: NP 一个数据都没有，就想到四年之后未免太高瞻远瞩了。
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y******8
发帖数: 1764 | 22 proton也许是1 um
bead本身没有极限，但是太小了，chip loading需要很大改动，没准要一个20k的
loader
再就是Ion的pH计原理让信号不稳定，尤其需要bead这个中介。这让今后的downsizing
变得困难。如果没有了bead，整个下限会多一个数量级，通量会上100倍。
去掉emPCR, 流程可能快很多。
这些都需要Ion推出新的芯片甚至机型，所以proton应该降价。
【在 t*d 的大作中提到】
: Ion 的bead现在多大？downsize 的极限在哪？
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s*********e
发帖数: 399 | 23 谁能估计一下nonopore估计测序什么价格？
小的那个大概$500－1， 000一个G
大的呢？ |
t*d
发帖数: 1290 | 24 谢谢！
Bead 据说做太小了 ，大小就不均匀，影响效果。
downsizing
【在 y******8 的大作中提到】
: proton也许是1 um
: bead本身没有极限，但是太小了，chip loading需要很大改动，没准要一个20k的
: loader
: 再就是Ion的pH计原理让信号不稳定，尤其需要bead这个中介。这让今后的downsizing
: 变得困难。如果没有了bead，整个下限会多一个数量级，通量会上100倍。
: 去掉emPCR, 流程可能快很多。
: 这些都需要Ion推出新的芯片甚至机型，所以proton应该降价。
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y******8
发帖数: 1764 | 25 大小是可以选择的，这显然不是理由。
【在 t*d 的大作中提到】
: 谢谢！
: Bead 据说做太小了 ，大小就不均匀，影响效果。
:
: downsizing
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t*d
发帖数: 1290 | 26 原来是这样。再谢一次！
【在 y******8 的大作中提到】
: 大小是可以选择的，这显然不是理由。
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t****p
发帖数: 1504 | |
g*********t
发帖数: 271 | |
S****u
发帖数: 42 | 29 有没有人想过这事后面的商业行为？
Illumina刚刚拒了Roche的bid。现在是Sequencing公司卖个好价钱的时候。急匆匆抛出
个每太多数据支持的Prototype。 |
s****l
发帖数: 10462 | 30 What's your hypothesis? 是Roche还是Illumina支持抛出来的？好像Illumina有15%的
NP股份。
另外，有谁知道除了那个DNA蛋白通道，NP还用了什么酶没有？
【在 S****u 的大作中提到】
: 有没有人想过这事后面的商业行为？
: Illumina刚刚拒了Roche的bid。现在是Sequencing公司卖个好价钱的时候。急匆匆抛出
: 个每太多数据支持的Prototype。
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b****r
发帖数: 17995 | 31 楼主的页面上这个链接给出了一些技术细节
http://pathogenomics.bham.ac.uk/blog/2012/02/oxford-nanopore-me
现在下结论显然为时过早，但是我的直觉的话，这个技术应该比其他现有技术远远要
promising，一个是读长，一个是单分子，一个是不要扩增，再一个原理也很简单不是
那种复杂的让人一想起来就头晕半天的东西。越简单的东西就越难造假。
至于测序错误，只要没有bias，多测几次后根本不是问题，这个楼上有人已经提到过了。
拭目以待
【在 t****p 的大作中提到】
: 什么技术细节都没有？
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f*******e
发帖数: 628 | 32 如果不扩增，很难保证能够重复多次的测某个特定分子的某个特定片段吧，这样就很难
判断错误是来源于测序错误或者 real 吧？
看了看好像不能像 PacBio 一样不停的轮回对同一个分子测序。Nanopore 的技术好像
至少用那个 exonuclease 的是测序同时也摧毁分子。Strand sequencing 也许还行，
不过很难保证这次测了之后还能再 capture 到同一个 strand 来测啊？
到最后 error 大概只能靠 coverage 来解决。
了。
【在 b****r 的大作中提到】
: 楼主的页面上这个链接给出了一些技术细节
: http://pathogenomics.bham.ac.uk/blog/2012/02/oxford-nanopore-me
: 现在下结论显然为时过早，但是我的直觉的话，这个技术应该比其他现有技术远远要
: promising，一个是读长，一个是单分子，一个是不要扩增，再一个原理也很简单不是
: 那种复杂的让人一想起来就头晕半天的东西。越简单的东西就越难造假。
: 至于测序错误，只要没有bias，多测几次后根本不是问题，这个楼上有人已经提到过了。
: 拭目以待
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s****l
发帖数: 10462 | 33 如果不能“capture 到同一个 strand 来测”，怎么用coverage解决error?
【在 f*******e 的大作中提到】
: 如果不扩增，很难保证能够重复多次的测某个特定分子的某个特定片段吧，这样就很难
: 判断错误是来源于测序错误或者 real 吧？
: 看了看好像不能像 PacBio 一样不停的轮回对同一个分子测序。Nanopore 的技术好像
: 至少用那个 exonuclease 的是测序同时也摧毁分子。Strand sequencing 也许还行，
: 不过很难保证这次测了之后还能再 capture 到同一个 strand 来测啊？
: 到最后 error 大概只能靠 coverage 来解决。
:
: 了。
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f*******e
发帖数: 628 | 34 对呀，这就是我觉着有问题的地方啊。只好希望 sample 在不扩增的情况下也不只一个
copy，而且 copy 数量足够，来达到需要的 coverage。
【在 s****l 的大作中提到】
: 如果不能“capture 到同一个 strand 来测”，怎么用coverage解决error?
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b****r
发帖数: 17995 | 35 illumina 454也都有错误也都不能轮回测同一个分子啊。只要某些DNA片段不会选择性
的不能通过那个pore，很难想象在足够多coverage后还会有大的gap。
nanopore不用nuclease切DNA啊，你在哪里看到的。文章里明确说了，测完后还能
recover DNA的。它这个理论上就是靠DNA不同的碱基和那个pore蛋白的物理互作测序，
可能是氢键吧
难道你以为是单细胞测序？不是的啊，打比方他说把血液直接加上去，血液里那么多白
细胞，每个里面都有两个copy的基因组
【在 f*******e 的大作中提到】
: 如果不扩增，很难保证能够重复多次的测某个特定分子的某个特定片段吧，这样就很难
: 判断错误是来源于测序错误或者 real 吧？
: 看了看好像不能像 PacBio 一样不停的轮回对同一个分子测序。Nanopore 的技术好像
: 至少用那个 exonuclease 的是测序同时也摧毁分子。Strand sequencing 也许还行，
: 不过很难保证这次测了之后还能再 capture 到同一个 strand 来测啊？
: 到最后 error 大概只能靠 coverage 来解决。
:
: 了。
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b****r
发帖数: 17995 | 36 你们都没有好好读文章
它说了，不用denature，就是直接读双链DNA
【在 s****l 的大作中提到】
: 如果不能“capture 到同一个 strand 来测”，怎么用coverage解决error?
|
s****l
发帖数: 10462 | 37 我的理解是样品中的核酸分子会不停的进出蛋白孔，如果没有降解的问题，只要有足够
长的时间，就可以产生足够多的序列信息，因为测过的分子还有重新来过。然后通过
assembly，可以得到统计一一上的正真序列。所以看它的介绍里面是说，你要设定一个
统计目的，然后让gridion/minion去测，当达到了你设定的可信区间，这个测序就完成
了。
【在 b****r 的大作中提到】
: illumina 454也都有错误也都不能轮回测同一个分子啊。只要某些DNA片段不会选择性
: 的不能通过那个pore，很难想象在足够多coverage后还会有大的gap。
: nanopore不用nuclease切DNA啊，你在哪里看到的。文章里明确说了，测完后还能
: recover DNA的。它这个理论上就是靠DNA不同的碱基和那个pore蛋白的物理互作测序，
: 可能是氢键吧
: 难道你以为是单细胞测序？不是的啊，打比方他说把血液直接加上去，血液里那么多白
: 细胞，每个里面都有两个copy的基因组
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f*******e
发帖数: 628 | 38 都有错误，所以 illumina 454 啥的都要事先 sample amplification。这个 nanopore
既然号称不需要 sample prep, 就需要解决单分子测序的 error 问题。当然如果
sample 本来就是 amplicon 就无所谓了。
哪个文章？他们网站上说是有两种 mode，其中一种是用 exonuclease 的。我理解那个
strand sequencing 不用 nuclease，但是具体怎么 把 double strand 弄成 single
strand，然后 single strand 通过了之后如何 recover 不是太明白。
我没以为是单细胞测序，所以才说 error 要通过 coverage 来解决。而 PacBio 的某
个解决 error 方法是循环的重复测某一个单分子，这一点 Nanopore 好像做不到，因
为我的理解是某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低。这个 error 的问
题，特别在 sample 本身很少的情况下，比如一个 finger stick 的血样，不能解决的
话就是个问题。
【在 b****r 的大作中提到】
: illumina 454也都有错误也都不能轮回测同一个分子啊。只要某些DNA片段不会选择性
: 的不能通过那个pore，很难想象在足够多coverage后还会有大的gap。
: nanopore不用nuclease切DNA啊，你在哪里看到的。文章里明确说了，测完后还能
: recover DNA的。它这个理论上就是靠DNA不同的碱基和那个pore蛋白的物理互作测序，
: 可能是氢键吧
: 难道你以为是单细胞测序？不是的啊，打比方他说把血液直接加上去，血液里那么多白
: 细胞，每个里面都有两个copy的基因组
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b****r
发帖数: 17995 | 39 我不太明白，为什么你说他会不停进出一个孔呢。想象一下，一条很长很长的链条（一
段DNA分子），进入一个刚刚够大的孔，你觉得让它在这个孔里来来回回难度大不大？
我相信其实是通过水压或者电磁力驱动DNA通过孔的，是单向的。实际上文章里也说了
，测完后可以重新收集侧过的DNA，没有损失
你说的可信区间，我不觉得和我的理解有任何矛盾。比如你加了10000个白细胞进去，
那么对于任何一个常染色体片段都是大约20000个拷贝，仍然是很多的，打比方你要测
21号染色体，你测到比如说
这20000个21号染色体有大约10次通过这个孔（哪怕其他染色体还没有到10次），你就
觉得到了你的可信区间了，就可以停下来了。
当然我也不觉得这个可信区间有太多意义，即使它一次能测50kb，对于一条染色体来说
还是要打断成很多片段才搞得定的，这么多次读取，平均分配到每条染色体的概率就很
大了，提前很多测完某条染色体的可能性并不太大
【在 s****l 的大作中提到】
: 我的理解是样品中的核酸分子会不停的进出蛋白孔，如果没有降解的问题，只要有足够
: 长的时间，就可以产生足够多的序列信息，因为测过的分子还有重新来过。然后通过
: assembly，可以得到统计一一上的正真序列。所以看它的介绍里面是说，你要设定一个
: 统计目的，然后让gridion/minion去测，当达到了你设定的可信区间，这个测序就完成
: 了。
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b****r
发帖数: 17995 | 40 sample amplification不是为了纠正错误吧？我记得一个是为了增大样品量，一个是为
了在amplicon两头加adaptor。amplification怎么纠正错误，你可否解释一下？
exonuclease干嘛用我确实也没看到，也许是把Mb级别的DNA搞成几十KB的，好一次测一
条吧
“某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低”，我在楼上帖解释了我的看法。
一个finger stick，那白细胞确实太少了，我不认为现在任何技术能很好地对其进行高
质量的NGS
nanopore
single
【在 f*******e 的大作中提到】
: 都有错误，所以 illumina 454 啥的都要事先 sample amplification。这个 nanopore
: 既然号称不需要 sample prep, 就需要解决单分子测序的 error 问题。当然如果
: sample 本来就是 amplicon 就无所谓了。
: 哪个文章？他们网站上说是有两种 mode，其中一种是用 exonuclease 的。我理解那个
: strand sequencing 不用 nuclease，但是具体怎么 把 double strand 弄成 single
: strand，然后 single strand 通过了之后如何 recover 不是太明白。
: 我没以为是单细胞测序，所以才说 error 要通过 coverage 来解决。而 PacBio 的某
: 个解决 error 方法是循环的重复测某一个单分子，这一点 Nanopore 好像做不到，因
: 为我的理解是某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低。这个 error 的问
: 题，特别在 sample 本身很少的情况下，比如一个 finger stick 的血样，不能解决的
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f*******e
发帖数: 628 | 41 一般的 sample amplification 是把一个单分子原始 DNA 在一个 bead （或者其他介
质）上扩增成序列一样的的足够多数量的分子。 这个过程产生的 error 很小，比如 <
0.1%, 可以忽略不计。说这个过程可以纠正 error, 是因为在后续 sequencing 的时候
是读取的 amplification 之后整体产生的信号，所以即使这个集合里面某些少量的分
子产生错误的信号, 也淹没在 noise 里，不影响集合读出的正确序列.
相比较之下，single molecule 的方法只读取一个原始分子的信息，比如 nanopore,
读错了就错了，没有这么一个纠正的机制，所以就只能靠大量的 coverage 来弥补。
根据 nanopore 的网站，他们用某种 dsDNA binding enzyme 在 nanopore 的端口来
unzip double strand, 所以最后通过 pore 读取的是 single stranded
trinucleotide。一个分子被测序之后不会回来反复被测。所以要靠测序的 coverage
来弥补错误的话，就需要 sample 里面有足够的 copy number，能在可以接受的时间内
达到这个 coverage.
当然我也不知道 4% error rate 到底是有多糟糕，需要提高多少的 coverage 才能弥
补。
法。
【在 b****r 的大作中提到】
: sample amplification不是为了纠正错误吧？我记得一个是为了增大样品量，一个是为
: 了在amplicon两头加adaptor。amplification怎么纠正错误，你可否解释一下？
: exonuclease干嘛用我确实也没看到，也许是把Mb级别的DNA搞成几十KB的，好一次测一
: 条吧
: “某个 strand 通过测序之后被重复测的几率很低很低”，我在楼上帖解释了我的看法。
: 一个finger stick，那白细胞确实太少了，我不认为现在任何技术能很好地对其进行高
: 质量的NGS
:
: nanopore
: single
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f*******e
发帖数: 628 | 42 文章说，Only about 0.001% of the starting DNA is processed。这才是他们号称不
消耗，可以做完之后还回收做别的。这样一个几率，比如你的例子，20000 个 copy,
只有 0.2 个分子有机会被测序到。所以这样一个 input，至少需要等 5x 的更长时间
，才可能被 process 到。而因为他们的 error rate 高，需要更高的 coverage, 所以
真正需要的时间更长。这样算一下，他们的 throughput 也有待提高。只处理 0.001%
的 starting material 感觉并不是什么好事，需要测的 target molecule 的丰度足够
高才行，量大都没用。
nanopore 通过的机制，感觉好像是通过 motor enzyme 来 ratchet，通过机械手段大
概不太能够做得足够小。
【在 b****r 的大作中提到】
: 我不太明白，为什么你说他会不停进出一个孔呢。想象一下，一条很长很长的链条（一
: 段DNA分子），进入一个刚刚够大的孔，你觉得让它在这个孔里来来回回难度大不大？
: 我相信其实是通过水压或者电磁力驱动DNA通过孔的，是单向的。实际上文章里也说了
: ，测完后可以重新收集侧过的DNA，没有损失
: 你说的可信区间，我不觉得和我的理解有任何矛盾。比如你加了10000个白细胞进去，
: 那么对于任何一个常染色体片段都是大约20000个拷贝，仍然是很多的，打比方你要测
: 21号染色体，你测到比如说
: 这20000个21号染色体有大约10次通过这个孔（哪怕其他染色体还没有到10次），你就
: 觉得到了你的可信区间了，就可以停下来了。
: 当然我也不觉得这个可信区间有太多意义，即使它一次能测50kb，对于一条染色体来说
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b****r
发帖数: 17995 | 43 谢谢
你读得比我更仔细,那个unzip double strand 的步骤确实没看到。
至于最后要多少个coverage，我没有算，你的描述里也没说出来，还是难以作出结论，
也许nanopore的coverage可以做到很高，这个还得花时间仔细算算。不过我觉得这个是
很难蒙混过关的，只要nanopore把数据拿出来，中学生也能算到很清楚，到底最后
coverage 多高，每个碱基精确性多高
你说的PCR even out error，我不太同意。你看看这个图
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n12/fig_tab/nmeth.1270_F
如果我没搞错，illumina现在仍然是基于这个原理，我理解的PCR是左下最后一个蓝框
，不是右第三个黄框。前面这个amplification仍然是error prone的，特别是对于染色
体的很多区段，可能扩增效率很低，而且还有pcr的error问题和allelic dropoff的问
题（这些缺陷nanopore都应该没有）。实际上你去看illunima 的raw data，错误还是
相当多的，不是你说的那样，基本上会被even out（那只是在珠子上克隆pcr产物的第
二次pcr才会存在的）。
还有一个nanodrop很大的优势是对于长片段的读取，从遗传病诊断的角度看来，这个优
势太重要了。很多时候我们做NGS，先要把序列align到 reference genome上去，如果
有indel和breakpoint，这样的序列都很可能会被扔掉。还有就是那些高度相似的同源
基因或者copy number variant的地方。对于这些潜在的致病突变，illumina那几十bp
的读长根本没法准确map。这样的话，很多时候你没有可能exhaustive的分析一个患者
的genome，始终无法给出一个足够高质量的结论。好比我们lab最近做了6个exome了，
还是不知道到底是没有突变呢，还是因为有大的indel或者inversion，然后
alignment的过程中被扔了。确实有一些软件能稍微捡回来一些这些序列，但是效率仍
然是很低的
所以说，我觉得只要是理论上能得到足够的coverage，nanopore对于genome
sequencing在human genome上的潜力应该还是巨大的，它理论上没有什么假阴性。假阳性也许
高一点，多用便宜的方法validate几次就能解决，但是假阴性高的话你是无能为力的，NGS的价格短
期内仍然会是瓶颈。
<
【在 f*******e 的大作中提到】
: 一般的 sample amplification 是把一个单分子原始 DNA 在一个 bead （或者其他介
: 质）上扩增成序列一样的的足够多数量的分子。 这个过程产生的 error 很小，比如 <
: 0.1%, 可以忽略不计。说这个过程可以纠正 error, 是因为在后续 sequencing 的时候
: 是读取的 amplification 之后整体产生的信号，所以即使这个集合里面某些少量的分
: 子产生错误的信号, 也淹没在 noise 里，不影响集合读出的正确序列.
: 相比较之下，single molecule 的方法只读取一个原始分子的信息，比如 nanopore,
: 读错了就错了，没有这么一个纠正的机制，所以就只能靠大量的 coverage 来弥补。
: 根据 nanopore 的网站，他们用某种 dsDNA binding enzyme 在 nanopore 的端口来
: unzip double strand, 所以最后通过 pore 读取的是 single stranded
: trinucleotide。一个分子被测序之后不会回来反复被测。所以要靠测序的 coverage
|
f*******e
发帖数: 628 | 44 我之前说的 amplification 的 error 就是指的在 bead 上面的 PCR，这个 error 是
在别的非 single molecule 方法里面可以 even out 的。之前 library prep 之类的
PCR，Nanopore 如果需要做，error 啊，bias 啊之类和其他方法相比没有劣势，大概
就是没必要用 adapter 吧。
需要多少 coverage, 我当然不知道，呵呵，每个系统可以自说自话，自己定义一个下
限，关键就是 customers 是不是接受了。还有就是用途不同，也许 4% 对有些人完全
不是问题。再加上 read length 长，这样 alignment 的 confidence 高，这里面如果
有因为 error 造成的 misalignment 也可以通过别的数据处理方法来弥补。
【在 b****r 的大作中提到】
: 谢谢
: 你读得比我更仔细,那个unzip double strand 的步骤确实没看到。
: 至于最后要多少个coverage，我没有算，你的描述里也没说出来，还是难以作出结论，
: 也许nanopore的coverage可以做到很高，这个还得花时间仔细算算。不过我觉得这个是
: 很难蒙混过关的，只要nanopore把数据拿出来，中学生也能算到很清楚，到底最后
: coverage 多高，每个碱基精确性多高
: 你说的PCR even out error，我不太同意。你看看这个图
: http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n12/fig_tab/nmeth.1270_F
: 如果我没搞错，illumina现在仍然是基于这个原理，我理解的PCR是左下最后一个蓝框
: ，不是右第三个黄框。前面这个amplification仍然是error prone的，特别是对于染色
|
b****r
发帖数: 17995 | 45 nanopore都说不纯化血样或者其他样品，可以说肯定是没有library prep的步骤的。你
说得很对，我们讨论半天，最后还得靠它自己拉出来溜溜看
很高兴能结识你这样的高手，希望今后能多交流
的
【在 f*******e 的大作中提到】
: 我之前说的 amplification 的 error 就是指的在 bead 上面的 PCR，这个 error 是
: 在别的非 single molecule 方法里面可以 even out 的。之前 library prep 之类的
: PCR，Nanopore 如果需要做，error 啊，bias 啊之类和其他方法相比没有劣势，大概
: 就是没必要用 adapter 吧。
: 需要多少 coverage, 我当然不知道，呵呵，每个系统可以自说自话，自己定义一个下
: 限，关键就是 customers 是不是接受了。还有就是用途不同，也许 4% 对有些人完全
: 不是问题。再加上 read length 长，这样 alignment 的 confidence 高，这里面如果
: 有因为 error 造成的 misalignment 也可以通过别的数据处理方法来弥补。
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m***T
发帖数: 11058 | 46 非常好的讨论，学习了。对于双链的DNA，它似乎是用hairpin的方式来读取的。
它的优势大家已经讨论过了，从一个竞争者的角度来看，我来提点它存在的问题（至少
从目前看）。
1、对于一个今年下半年就要上市的产品，到现在都没有真正的data出来供大家参考。
它present的data太小，能不能scalable，如何能做到scalable后保持相同甚至更高的
accurate rate，是它要面临的一个大问题。
2、用protein做介质，稳定性能否保证。看介绍它们只能保证6个小时，临界情况下的
data quality如何，这个还得等到有了具体的data才能知道。
3、它依赖于长而完整的DNA来有效测量，那么对于一些短的sequences诸如short
amplicons及FFPE等临床样本则基本上没有用武之地。不知道这个是不是它的一个短板？
还有些其它的，但觉得这几点最重要。 |
y******8
发帖数: 1764 | 47 I would say there are two problems.
1. IT support. All previous sequencing data are from short reads, less than
500 bp. Very challenging for IT people to develop effective tools in a
relative short time.
2. Before its scale can handle 10x human genome, no big bonus to attract
current NextGen users.
I think other competitors would have two years to catch up with the
technology, and 3-4 years to adjust marketing strategy.
I think they might keep each chamber small, and increase the module numbers.
Protein is stable, but the pore still needs energy. 6 hours might consume
the ATP supply in solution.
板？
If it can handle RNA seq, no reason it will fail on FFPE samples.
【在 m***T 的大作中提到】
: 非常好的讨论，学习了。对于双链的DNA，它似乎是用hairpin的方式来读取的。
: 它的优势大家已经讨论过了，从一个竞争者的角度来看，我来提点它存在的问题（至少
: 从目前看）。
: 1、对于一个今年下半年就要上市的产品，到现在都没有真正的data出来供大家参考。
: 它present的data太小，能不能scalable，如何能做到scalable后保持相同甚至更高的
: accurate rate，是它要面临的一个大问题。
: 2、用protein做介质，稳定性能否保证。看介绍它们只能保证6个小时，临界情况下的
: data quality如何，这个还得等到有了具体的data才能知道。
: 3、它依赖于长而完整的DNA来有效测量，那么对于一些短的sequences诸如short
: amplicons及FFPE等临床样本则基本上没有用武之地。不知道这个是不是它的一个短板？
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s******s
发帖数: 13035 | 48 关于3，你是技术更新了老的方法都忘了。在next gene之前，用测序测表达，
就把cDNA加接头，然后切成固定大小片段，然后几十个ligate在一起，作为
一个反应去测序。nanopore显然可以用这样的方法，也就是样品要处理一下
而已，这个比library还是简单
板？
【在 m***T 的大作中提到】
: 非常好的讨论，学习了。对于双链的DNA，它似乎是用hairpin的方式来读取的。
: 它的优势大家已经讨论过了，从一个竞争者的角度来看，我来提点它存在的问题（至少
: 从目前看）。
: 1、对于一个今年下半年就要上市的产品，到现在都没有真正的data出来供大家参考。
: 它present的data太小，能不能scalable，如何能做到scalable后保持相同甚至更高的
: accurate rate，是它要面临的一个大问题。
: 2、用protein做介质，稳定性能否保证。看介绍它们只能保证6个小时，临界情况下的
: data quality如何，这个还得等到有了具体的data才能知道。
: 3、它依赖于长而完整的DNA来有效测量，那么对于一些短的sequences诸如short
: amplicons及FFPE等临床样本则基本上没有用武之地。不知道这个是不是它的一个短板？
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s******s
发帖数: 13035 | 49 我倒是考虑一个关于error的问题，nanopore的error是不是随机的？
illumina等现在的方法，虽然error有bias，但是大致是随机出现的，
当然一堆T啥的可能错误多点？那么从nanopore的原理来说，考虑到
周边碱基影响，那么会不会对某一块序列怎么读都有很高的错误率？
【在 s******s 的大作中提到】
: 关于3，你是技术更新了老的方法都忘了。在next gene之前，用测序测表达，
: 就把cDNA加接头，然后切成固定大小片段，然后几十个ligate在一起，作为
: 一个反应去测序。nanopore显然可以用这样的方法，也就是样品要处理一下
: 而已，这个比library还是简单
:
: 板？
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f*******e
发帖数: 628 | 50 第三点不是太明白。为什么 nanopore 依赖于长而完整的 DNA 来测量呢？Nanopore 在
测长的DNA 上面有优势，号称没有 read length 的上限，然而我没有找到导致它不能
测短的因素啊？比如几百个 bp 的 amplicon, 难道不能被 capture 来读取么？
板？
【在 m***T 的大作中提到】
: 非常好的讨论，学习了。对于双链的DNA，它似乎是用hairpin的方式来读取的。
: 它的优势大家已经讨论过了，从一个竞争者的角度来看，我来提点它存在的问题（至少
: 从目前看）。
: 1、对于一个今年下半年就要上市的产品，到现在都没有真正的data出来供大家参考。
: 它present的data太小，能不能scalable，如何能做到scalable后保持相同甚至更高的
: accurate rate，是它要面临的一个大问题。
: 2、用protein做介质，稳定性能否保证。看介绍它们只能保证6个小时，临界情况下的
: data quality如何，这个还得等到有了具体的data才能知道。
: 3、它依赖于长而完整的DNA来有效测量，那么对于一些短的sequences诸如short
: amplicons及FFPE等临床样本则基本上没有用武之地。不知道这个是不是它的一个短板？
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b****r
发帖数: 17995 | 51 这个没有看到有提到，我猜如果测短序列速度慢的话，可能是因为DNA进入那个pore的
速度是个瓶颈吧。可以想象一下，那么小的一个DNA头，要进入一个和它几乎一样大的
孔，温度还不能太高，恐怕确实不容易
【在 f*******e 的大作中提到】
: 第三点不是太明白。为什么 nanopore 依赖于长而完整的 DNA 来测量呢？Nanopore 在
: 测长的DNA 上面有优势，号称没有 read length 的上限，然而我没有找到导致它不能
: 测短的因素啊？比如几百个 bp 的 amplicon, 难道不能被 capture 来读取么？
:
: 板？
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b****r
发帖数: 17995 | 52 估计有可能，DNA，特别是它说的这种没有变性的DNA，恐怕二级结构甚至三级结构都还
存在的
【在 s******s 的大作中提到】
: 我倒是考虑一个关于error的问题，nanopore的error是不是随机的？
: illumina等现在的方法，虽然error有bias，但是大致是随机出现的，
: 当然一堆T啥的可能错误多点？那么从nanopore的原理来说，考虑到
: 周边碱基影响，那么会不会对某一块序列怎么读都有很高的错误率？
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f*******e
发帖数: 628 | 53 有这个瓶颈的话，应该是长的 DNA 才更难进入。
大概影响速度的瓶颈在目标分子到达 pore 所需要的时间，之后真正测序反而很快。所
以分子长的话，一旦碰到一个可以一直测序很长一段，每个 pore 的利用效率高。分子
短的话，读过之后又要闲置等待下一个分子进入。
【在 b****r 的大作中提到】
: 这个没有看到有提到，我猜如果测短序列速度慢的话，可能是因为DNA进入那个pore的
: 速度是个瓶颈吧。可以想象一下，那么小的一个DNA头，要进入一个和它几乎一样大的
: 孔，温度还不能太高，恐怕确实不容易
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b****r
发帖数: 17995 | 54 就是这个意思了，大分子虽然可能更难进，但是一个就能测几十k，比起几百BP的小片
段还是效率高
【在 f*******e 的大作中提到】
: 有这个瓶颈的话，应该是长的 DNA 才更难进入。
: 大概影响速度的瓶颈在目标分子到达 pore 所需要的时间，之后真正测序反而很快。所
: 以分子长的话，一旦碰到一个可以一直测序很长一段，每个 pore 的利用效率高。分子
: 短的话，读过之后又要闲置等待下一个分子进入。
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y***i
发帖数: 11639 | 55 从讨论来看似乎真是比较有希望的样子。看来得学NGS了，没太多时间就真得用得上了。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 56 one decade later PCR and shot gun will just an ancient tale...
【在 b****r 的大作中提到】
: 就是这个意思了，大分子虽然可能更难进，但是一个就能测几十k，比起几百BP的小片
: 段还是效率高
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