l*****5
发帖数: 197 | 1 大家好，现在遇到一个问题不知道怎么解决，希望在此得到帮助，不甚感激！
我用recombinent protein 做一个in vitro assay，最终希望得到一个比较纯，浓度比
较高的dimer，所以一个是His tag，另外一个是GST tag，计划用两次纯化得到最终产
物，其间涉及到另外三种enzyme,实验室以前别人做的，都是His tag。
按理说，整个反应的过程没有多大难度，有一些文章也有receipe，但因为我需要的是
最终的产物，然后再接着往下做别的，所以希望能做的多一些，也需要浓度大一些。但
我已经试了3、4次了，基本上每次做都会缓慢的出现絮状的沉淀，就好像蛋白变性的那
种感觉，会不会是我用的反应浓度比paper上的浓？但我需要的量比较大啊。。。lab以
前的师兄做过，效果还可以，我的浓度是他的5倍，而且总体的量也多很多，他以前做
的量都比较少，也不需要纯化之类的，师兄毕业走人了，而且他一直就用比较稀的浓度。
还有，我试着将离心后的上清过Thermo Pierce的glutathione agarose beads,可以看
到蛋白有吸附（有YFP tag），但我最后用10mM的 reduced glutathione elute时发现
蛋白根本就下不来，因为有YFP tag，所以能很明显的看到，根本就不动。
这是怎么回事呢，是蛋白在beads上变性沉淀了，然后下不来了吗？我的反应溶液里有
Tris, MgCl2, ATP,DTT; GST纯化的washing buffer用的就是 Thermo protocol的Tris,
NaCl.
非常感谢大家的帮助！ |
k******0
发帖数: 1073 | 2 很可能是你的重组蛋白质不稳定，所以在溶液中出现沉淀，在GST Beads上聚集，不能
被洗脱。 |
l*****5
发帖数: 197 | |
C*******e
发帖数: 4348 | 4 不太明白你说的是要得到两个蛋白的复合物，一个his-一个GST-
还是说同一个蛋白，一个version是his-，另一个是GST-
如果是前者，不要太贪心
先用比较稀的浓度得到复合物以后再浓缩
不过有的蛋白就是容易在高浓度下析出
碰到了也没办法
可以试着加点glycerol之类的在溶液里看看有没有帮助（从提蛋白开始）
另外你说的GST-tag那个问题
好像不管用什么tag的话多多少少都会有些蛋白“死”在柱子上
因为你有YFP fusion所以很容易看到了
不代表以前你做的蛋白没有“死”在柱子上的
如果你的GST-tag是可以切除的
试试on column digestion |
l*****5
发帖数: 197 | 5 是一个His, 一个GST tag的
切这个问题好像有点麻烦，因为都是thrombin的，所以一切就都没了，而且不知道
efficiency如何，现在lab里别人做的都认为切的效率太低。
我先试试浓缩，有没有可能在beads上直接反应？ |
C*******e
发帖数: 4348 | 6 还是没明白你到底要做一个蛋白，还是两个蛋白
建议你先纯化到蛋白的复合物以后再浓缩
不要浓缩以后再把两个蛋白混起来
浓缩的话大体积可以用centricon
体积小的话用minicon
【在 l*****5 的大作中提到】
: 是一个His, 一个GST tag的
: 切这个问题好像有点麻烦，因为都是thrombin的，所以一切就都没了，而且不知道
: efficiency如何，现在lab里别人做的都认为切的效率太低。
: 我先试试浓缩，有没有可能在beads上直接反应？
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k******0
发帖数: 1073 | 7 目标蛋白质不稳定，是由于表达出与native蛋白质不一样的结构，酶活也是很低，基本
上很难矫正。可以尝试不同的表达系统。 |
