j*****q
发帖数: 82 | 1 做了个克隆，酶切验证。条带位置是对的，测序也没问题。
但是一直有一条诡异的带（图中箭头所指）。没有酶切的plasmid做对照里也有这条带
。换个其他酶来切，还是有这条带。
大虾能否解惑一下。先谢过。 |
f**********r
发帖数: 95 | |
j*****q
发帖数: 82 | 3 图在这里的说。。。
lane1 是没有酶切的negative control，
lane2是酶切的结果，上下两条带的位置是对的。
【在 j*****q 的大作中提到】
: 做了个克隆，酶切验证。条带位置是对的，测序也没问题。
: 但是一直有一条诡异的带（图中箭头所指）。没有酶切的plasmid做对照里也有这条带
: 。换个其他酶来切，还是有这条带。
: 大虾能否解惑一下。先谢过。
|
e***o
发帖数: 60 | 4 like bacteria genomic DNA. |
z*******o
发帖数: 1794 | 5 类似的现象我碰到过一次，原因是：楼主的菌不是单克隆，所以你提出来的质粒也混了
其他的无关质粒。如果是这种情况，可以挑菌划板，挑两个单克隆提质粒看看是否还有
这种现象。 |
n********k
发帖数: 2818 | 6 it could also be there are too different plasmids there...it is not easy to
get rid of it...do transformation with very diluted plasmid DNA...I ran into
a similar problem once but it wasn't a problem for my cloning, i never
bother to do anything with it...
【在 z*******o 的大作中提到】
: 类似的现象我碰到过一次，原因是：楼主的菌不是单克隆，所以你提出来的质粒也混了
: 其他的无关质粒。如果是这种情况，可以挑菌划板，挑两个单克隆提质粒看看是否还有
: 这种现象。
|
D****n
发帖数: 14 | |
j*****q
发帖数: 82 | 8 这个问题最近ms有点更严重了。因为其他的plasmid里也出现了这样的情况。试了重新
划板，还是有。如果是其他plasmid污染，这个plasmid是在transformation前就混在我
转的plasmid里的呢还是就已经存在在感受态里的呢？我现在很怀疑感受态也给污染了。
再问个基础的问题，两个plasmid能同时transform到一个bacteria然后都复制下来吗？ |
c********b
发帖数: 363 | 9 可以的，我干过。
了。
【在 j*****q 的大作中提到】
: 这个问题最近ms有点更严重了。因为其他的plasmid里也出现了这样的情况。试了重新
: 划板，还是有。如果是其他plasmid污染，这个plasmid是在transformation前就混在我
: 转的plasmid里的呢还是就已经存在在感受态里的呢？我现在很怀疑感受态也给污染了。
: 再问个基础的问题，两个plasmid能同时transform到一个bacteria然后都复制下来吗？
|
b******n
发帖数: 4225 | 10 这个不是污染的质粒，很可能就是你的目的质粒
但是因为溶液2处理时间过长（就是lysis solution）
导致你的部分目的质粒变性了，这种变性的质粒resistant to enzyme digestion
你可以回头查查qiagen的质粒抽提的说明书
【在 j*****q 的大作中提到】
: 图在这里的说。。。
: lane1 是没有酶切的negative control，
: lane2是酶切的结果，上下两条带的位置是对的。
|
|
|
q*******8
发帖数: 768 | 11 这明显是SUPERCOIL啊。。。对照是三条带，最下面的就是SUPERCOIL。你没有切完整/
质粒浓度过高（都拖尾成这样了！！！）。把质粒稀释5倍，加>0.3ul酶37度>2小时 应
该可以切完整了。 |
j*****q
发帖数: 82 | 12 酶切的plasmid不算多啊，1个微克左右。
刚开始也是觉得是没切彻底，但是有个对照的plasmid，序列很相似的，但是却切的很
干净。所以觉得是污染，但是每次都是这个位置，然后量也不算少，就怀疑是菌给污染
了，明天做个control，先把菌污染给排查一下。再看看是不是buffer2时间太长了。 |
b******n
发帖数: 4225 | 13 看看这个心里就有数了
http://www.qiagen.com/plasmid/agarosegelanalysis.aspx
胶图的lane 1
【在 j*****q 的大作中提到】
: 酶切的plasmid不算多啊，1个微克左右。
: 刚开始也是觉得是没切彻底，但是有个对照的plasmid，序列很相似的，但是却切的很
: 干净。所以觉得是污染，但是每次都是这个位置，然后量也不算少，就怀疑是菌给污染
: 了，明天做个control，先把菌污染给排查一下。再看看是不是buffer2时间太长了。
|
n********k
发帖数: 2818 | 14 I had a look of your picture again, I think Bulletin might be right...
【在 j*****q 的大作中提到】
: 酶切的plasmid不算多啊，1个微克左右。
: 刚开始也是觉得是没切彻底，但是有个对照的plasmid，序列很相似的，但是却切的很
: 干净。所以觉得是污染，但是每次都是这个位置，然后量也不算少，就怀疑是菌给污染
: 了，明天做个control，先把菌污染给排查一下。再看看是不是buffer2时间太长了。
|
j*****q
发帖数: 82 | 15 多谢楼上各位。小弟检查一下lysis的步骤，再上来汇报 |
k****o
发帖数: 589 | 16 之前用EcoRI切过吗？如bulletin说的，像是裂解步骤出的问题。 |
j*****q
发帖数: 82 | 17 小弟又来汇报个新问题，按照ls几位的指点，注意了lysis的时间，现在发现还是有一
条酶无法切开的带。在circular plasmid也有这条带，但是跟lysis过程中的那条带位
置不一样，看着象是supercoil，但是为什么切不开呢？
见图
lane6和7是不同的酶切的，8是plasmid control |
j*****q
发帖数: 82 | 18 忘了说了，lane6里中间那条带就是没切开的，lane 8里也有，但是load的dna不多，所
以不明显。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 19 Bingo
LZ
please refer this paper reported method:
Balagurumoorthy et al. (2008)
Method to eliminate linear DNA from mixture containing nicked circular,
supercoiled, and linear plasmid DNA.
Anal Biochem. 381: 172-174.
link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18638445
【在 b******n 的大作中提到】
: 看看这个心里就有数了
: http://www.qiagen.com/plasmid/agarosegelanalysis.aspx
: 胶图的lane 1
|
j*****q
发帖数: 82 | 20 我这条带不是linear plasmid的带。关键是用酶切不开。 |
