z***3
发帖数: 496 | 1 想请教一下关于显微镜的问题
一般的显微镜有旋钮可以调节物镜的上下移动，旋钮是有刻度的。 不知道有没办法可
以知道， 旋几格刻度就是物镜移动了2微米，旋几格刻度就是物镜移动了5微米呢？ 有
什么实验可以验证呢？
其实我现在要做的是关于raman的depth profiling
http://www.mitbbs.com/article_t0/Chemistry/31374951.html
非常感谢
（不好意思，已经修改，应该是微米） |
s******y
发帖数: 28562 | 2 买一个游标卡尺，量物镜和观测台的距离，然后转上几十圈，再量，测量出
物镜的位移数，除于圈数，就大致是每圈转动移动的距离。
【在 z***3 的大作中提到】
: 想请教一下关于显微镜的问题
: 一般的显微镜有旋钮可以调节物镜的上下移动，旋钮是有刻度的。 不知道有没办法可
: 以知道， 旋几格刻度就是物镜移动了2微米，旋几格刻度就是物镜移动了5微米呢？ 有
: 什么实验可以验证呢？
: 其实我现在要做的是关于raman的depth profiling
: http://www.mitbbs.com/article_t0/Chemistry/31374951.html
: 非常感谢
: （不好意思，已经修改，应该是微米）
|
s*****j
发帖数: 6435 | 3 一个刻度尺就行了.
【在 s******y 的大作中提到】
: 买一个游标卡尺，量物镜和观测台的距离，然后转上几十圈，再量，测量出
: 物镜的位移数，除于圈数，就大致是每圈转动移动的距离。
|
S*R
发帖数: 1057 | 4 如果是带激光的显微镜，可以精确知道刻度对应的厚度。
先聚焦到已经知道的玻璃厚度（如300微米的或者1 毫米）上表面，慢慢旋转，记下旋
转了多少刻度可以聚焦到玻璃另外一面。就可以算出来了。
【在 z***3 的大作中提到】
: 想请教一下关于显微镜的问题
: 一般的显微镜有旋钮可以调节物镜的上下移动，旋钮是有刻度的。 不知道有没办法可
: 以知道， 旋几格刻度就是物镜移动了2微米，旋几格刻度就是物镜移动了5微米呢？ 有
: 什么实验可以验证呢？
: 其实我现在要做的是关于raman的depth profiling
: http://www.mitbbs.com/article_t0/Chemistry/31374951.html
: 非常感谢
: （不好意思，已经修改，应该是微米）
|
z***3
发帖数: 496 | 5 非常感谢ls各位的信息
我们的是带激光的显微镜 可为什么带激光的会精确些呢？ |
f******e
发帖数: 125 | 6 你可以用一些已知尺寸的珠子，从珠子顶到底是多长，你转旋钮转了多少。
【在 z***3 的大作中提到】
: 想请教一下关于显微镜的问题
: 一般的显微镜有旋钮可以调节物镜的上下移动，旋钮是有刻度的。 不知道有没办法可
: 以知道， 旋几格刻度就是物镜移动了2微米，旋几格刻度就是物镜移动了5微米呢？ 有
: 什么实验可以验证呢？
: 其实我现在要做的是关于raman的depth profiling
: http://www.mitbbs.com/article_t0/Chemistry/31374951.html
: 非常感谢
: （不好意思，已经修改，应该是微米）
|
p*l
发帖数: 1359 | 7 拿块不太干净的cover slip，phase contrast 下看两面的灰尘，然后cover slip的厚
度除以两面聚焦位置的刻度。 |
a****e
发帖数: 186 | 8 这样能测出个大概，但是是不准的。因为玻璃的折射率比空气高很多，光线会发生折射
，类似于水杯中的筷子，导致测得值比实际值小。
可以用两块载玻片，一上以下左右错开，聚焦到上表面后移开第一片玻璃，再聚焦到下
面一块的上表面。这个方法激光和白光都适用。
【在 S*R 的大作中提到】
: 如果是带激光的显微镜，可以精确知道刻度对应的厚度。
: 先聚焦到已经知道的玻璃厚度（如300微米的或者1 毫米）上表面，慢慢旋转，记下旋
: 转了多少刻度可以聚焦到玻璃另外一面。就可以算出来了。
|
p*l
发帖数: 1359 | 9 玻璃折射率1.5，单片coverslip的厚度除以1.5就是等效的空气中的厚度。这种等效计
算方法在classial optical engineering 中叫 reduced thickness。
【在 a****e 的大作中提到】
: 这样能测出个大概，但是是不准的。因为玻璃的折射率比空气高很多，光线会发生折射
: ，类似于水杯中的筷子，导致测得值比实际值小。
: 可以用两块载玻片，一上以下左右错开，聚焦到上表面后移开第一片玻璃，再聚焦到下
: 面一块的上表面。这个方法激光和白光都适用。
|
l********k
发帖数: 14844 | 10 用coverslip作spacer，做一个tunnel slide，中间滴上水。滴水之前，在tunnel上下
表面（glass slide和cover slip），tunnel的内侧用笔画两个标记，用来focus，然后
就是数圈圈了。
coverslip的厚度一般是0.17mm, 你可以用几个coverslip叠起来用。 |
|
|
a****e
发帖数: 186 | 11 你说的是pathlength, 是计算光传播的时间延迟时候用到的；这里讨论的是实际厚度，
reduced thickness不适用。
【在 p*l 的大作中提到】
: 玻璃折射率1.5，单片coverslip的厚度除以1.5就是等效的空气中的厚度。这种等效计
: 算方法在classial optical engineering 中叫 reduced thickness。
|
a****e
发帖数: 186 | 12 滴水是为了模拟样品折射率么？
coverslip有一个厚度范围，误差区间大概200微米，最好用卡尺或者micrometer量下
【在 l********k 的大作中提到】
: 用coverslip作spacer，做一个tunnel slide，中间滴上水。滴水之前，在tunnel上下
: 表面（glass slide和cover slip），tunnel的内侧用笔画两个标记，用来focus，然后
: 就是数圈圈了。
: coverslip的厚度一般是0.17mm, 你可以用几个coverslip叠起来用。
|
l********k
发帖数: 14844 | 13 恩ls有人提到index of refraction mismatch造成的z方向的压缩。看你的sample是什
么折射率了。通常只要有mismatch就需要有个修正，而这个修正和numerical apature
很有关系，不一定是折射率的比，尤其是对于大数值孔径的镜头。 |
l********k
发帖数: 14844 | 14 是啊，大多数样品是1.33吧。别到时候lz量了半天，要么是没修正的，要么是按空气修
正的，最后定量计算z的时候出笑话。
我说的是盖玻片，170um那种，我的经验误差通常在5um以下。不过拿卡尺量量是必须的。
【在 a****e 的大作中提到】
: 滴水是为了模拟样品折射率么？
: coverslip有一个厚度范围，误差区间大概200微米，最好用卡尺或者micrometer量下
|
l********k
发帖数: 14844 | 15 珠子自己是个透镜，有折射...
【在 f******e 的大作中提到】
: 你可以用一些已知尺寸的珠子，从珠子顶到底是多长，你转旋钮转了多少。
|
t******t
发帖数: 3045 | 16 一般说来，除了旋钮上有刻度，垂直的方向也有刻度
拿个尺子量一下垂直方向的刻度，然后除以旋钮上刻度的个数（一般转一圈，垂直方向
动一格），就是旋钮转一格移动的距离了 |
a****e
发帖数: 186 | 17 没具体测过coverslip的厚度误差，fisher标称的误差挺大的，实际上可能比较小，特
别是同一个batch的。
的。
【在 l********k 的大作中提到】
: 是啊，大多数样品是1.33吧。别到时候lz量了半天，要么是没修正的，要么是按空气修
: 正的，最后定量计算z的时候出笑话。
: 我说的是盖玻片，170um那种，我的经验误差通常在5um以下。不过拿卡尺量量是必须的。
|
l********k
发帖数: 14844 | 18 还是适用的。看lz的镜头是water immersion, oil immersion还是啥immersion都没有
的。
http://www.microscopyu.com/articles/optics/waterimmersionobject
【在 a****e 的大作中提到】
: 你说的是pathlength, 是计算光传播的时间延迟时候用到的；这里讨论的是实际厚度，
: reduced thickness不适用。
|
t******t
发帖数: 3045 | 19 没那么麻烦
在白纸上用黑笔画个叉
找个1mm的塑料或者玻璃片，用红笔画个圈
先聚焦到白纸上的黑叉
放上片，再聚焦到红圈，看看要转多少圈
【在 f******e 的大作中提到】
: 你可以用一些已知尺寸的珠子，从珠子顶到底是多长，你转旋钮转了多少。
|
a****e
发帖数: 186 | 20 我理解的reduced thickness 是infinite system里的光程关系，和NA无关。可能理解
有误。
【在 l********k 的大作中提到】
: 还是适用的。看lz的镜头是water immersion, oil immersion还是啥immersion都没有
: 的。
: http://www.microscopyu.com/articles/optics/waterimmersionobject
|
|
|
s*****j
发帖数: 6435 | 21 5um太小了. 一般 160um - 190um 都可以归到 #1.5 里面去.
的。
【在 l********k 的大作中提到】
: 是啊，大多数样品是1.33吧。别到时候lz量了半天，要么是没修正的，要么是按空气修
: 正的，最后定量计算z的时候出笑话。
: 我说的是盖玻片，170um那种，我的经验误差通常在5um以下。不过拿卡尺量量是必须的。
|
s*****j
发帖数: 6435 | 22 根本不是一回事. 难为你还 "classial optical engineering".
【在 p*l 的大作中提到】
: 玻璃折射率1.5，单片coverslip的厚度除以1.5就是等效的空气中的厚度。这种等效计
: 算方法在classial optical engineering 中叫 reduced thickness。
|
D*a
发帖数: 6830 | 23 为啥要量这个，找个confocal量你要量的东西不就完了。n幅图像 x z轴距离 |
z***3
发帖数: 496 | 24 非常感谢ls各位的信息呀
其实我现在要做的是关于raman的depth profiling
http://www.mitbbs.com/article_t0/Chemistry/31374951.html
悲曲的是，我们的raman旋钮上有刻度，垂直的方向没有刻度。。。
物镜好像是不能泡的
因为实验的时候是需要每几微米移动一下，这个距离的控制还是很重要的 |
l********k
发帖数: 14844 | 25 lz的样品可能比较大，他提的单位都是毫米，confocal也就看看几十微米厚的sample撑
死了。而且可能他手头就那个显微镜，没有别的。再者，lz的钻研精神和好奇心还是真
心值得提倡的。
confocal也有折射率不匹配造成的z-distortion的问题，提醒你一下。对于高数值孔径
的显微镜，这个修正可以达到100%。
【在 D*a 的大作中提到】
: 为啥要量这个，找个confocal量你要量的东西不就完了。n幅图像 x z轴距离
|
s******y
发帖数: 28562 | 26 用我说的那个方法最简单也最直接。
但是如果你需要非常准确的话(10纳米量级），必须用motorized stage.
【在 z***3 的大作中提到】
: 非常感谢ls各位的信息呀
: 其实我现在要做的是关于raman的depth profiling
: http://www.mitbbs.com/article_t0/Chemistry/31374951.html
: 悲曲的是，我们的raman旋钮上有刻度，垂直的方向没有刻度。。。
: 物镜好像是不能泡的
: 因为实验的时候是需要每几微米移动一下，这个距离的控制还是很重要的
|
a****e
发帖数: 186 | 27 NA不大的话这个方法行的
【在 s******y 的大作中提到】
: 用我说的那个方法最简单也最直接。
: 但是如果你需要非常准确的话(10纳米量级），必须用motorized stage.
|
l********k
发帖数: 14844 | 28 10nm，上piezo
【在 s******y 的大作中提到】
: 用我说的那个方法最简单也最直接。
: 但是如果你需要非常准确的话(10纳米量级），必须用motorized stage.
|
D*a
发帖数: 6830 | 29 显微镜能放10毫米的样品照相吗？
我们楼公用的共聚焦是直接设定移动的微米距离的，看着也挺古董了。
能不能讲讲什么叫z-distortion？或者给个网页什么的。我刚入门级别，谢拉。
【在 l********k 的大作中提到】
: lz的样品可能比较大，他提的单位都是毫米，confocal也就看看几十微米厚的sample撑
: 死了。而且可能他手头就那个显微镜，没有别的。再者，lz的钻研精神和好奇心还是真
: 心值得提倡的。
: confocal也有折射率不匹配造成的z-distortion的问题，提醒你一下。对于高数值孔径
: 的显微镜，这个修正可以达到100%。
|
l********k
发帖数: 14844 | 30 我们隔壁实验室作worm的，他们用的显微镜放大倍数低，working distance有好几厘米
，都是直接放petri dish。放大倍数越高，以及对numerical apature要求越高的镜头
，working distance通常越短。而轴向(z)分辨率最重要的一个参数就是NA。所以作z-
sectioning能达到300nm以下解析度的显微镜，比如confocal，objective一般NA都在1.
4以上，而working distance通常不超过0.3mm.
关于折射率不匹配造成的z-distortion，日常生活经验就常见，比如长辈曾经说游泳池
、水塘实际比看着深，不要下去游泳之类。
一般来讲，只要有mismatch就会有distortion，这也是water immersion objective相
比oil immersion的优点之一（盖玻片两边都是水）。这个distortion的修正粗略地讲
就是两边折射率的比值，但是对于大角度的非傍轴光线就不适用了。所以高NA的镜头的
修正不是简单的1.5/1.33（玻璃／水）。或者1/1.33（空气／水） 更详细的解释看我
前面贴的图和link。
microscopyu.com是个很好的地方，东西挺新，也比较准确。
【在 D*a 的大作中提到】
: 显微镜能放10毫米的样品照相吗？
: 我们楼公用的共聚焦是直接设定移动的微米距离的，看着也挺古董了。
: 能不能讲讲什么叫z-distortion？或者给个网页什么的。我刚入门级别，谢拉。
|
|
|
l********k
发帖数: 14844 | 31 A comparison of imaging ray traces that occur between the specimen and
immersion objectives (both oil and water) is presented in Figure 3, along
with a geometric model prediction of an x-z image for a fluorescent bead 100
micrometers below the interface in aqueous media. In Figure 3(a), the
sphere on the left represents the actual shape of the fluorescent bead,
while the elongated shape on the right is the impression provided by imaging
with an oil immersion objective. Ray traces (yellow arrows in Figure 3)
from the bead into the front lens of an oil immersion objective (Figure 3(b)
) and water immersion objective (Figure 3(c)) reveal details about how the
refractive index mismatch obscures actual specimen geometry. In aqueous
media, the bead is distorted into an apparent elongated oval when imaged
with an oil immersion objective as illustrated in Figure 3(b), but remains
spherical when using a water immersion objective (Figure 3(c)). The actual
specimens are represented by a blue sphere and the apparent images are
indicated as a red oval or red sphere.
【在 D*a 的大作中提到】
: 显微镜能放10毫米的样品照相吗？
: 我们楼公用的共聚焦是直接设定移动的微米距离的，看着也挺古董了。
: 能不能讲讲什么叫z-distortion？或者给个网页什么的。我刚入门级别，谢拉。
|
D*a
发帖数: 6830 | 32 很清楚啊，多谢！
100
imaging
b)
【在 l********k 的大作中提到】
: A comparison of imaging ray traces that occur between the specimen and
: immersion objectives (both oil and water) is presented in Figure 3, along
: with a geometric model prediction of an x-z image for a fluorescent bead 100
: micrometers below the interface in aqueous media. In Figure 3(a), the
: sphere on the left represents the actual shape of the fluorescent bead,
: while the elongated shape on the right is the impression provided by imaging
: with an oil immersion objective. Ray traces (yellow arrows in Figure 3)
: from the bead into the front lens of an oil immersion objective (Figure 3(b)
: ) and water immersion objective (Figure 3(c)) reveal details about how the
: refractive index mismatch obscures actual specimen geometry. In aqueous
|
s****1
发帖数: 1519 | 33 我用过两种显微镜，Nikon & Olympus，貌似都是一小格一微米。Manual里面可能有。 |
z***3
发帖数: 496 | 34 先谢谢ls各位
Manual确实有句话 High stability BX 40. Focus graduation 1 micro meter.
但不确定是否意思就是每小格一微米 |
