C********4 发帖数: 308 | 1 看了一下做K/O老鼠的流程
疑问:
1 要获得K/O ES细胞系,为什么要先得到K/O老鼠,再分离inner cell mass啊?不
能直接在ES细胞里面K/O了,直接用于实验吗?
2 能在一般的细胞系里面直接做K/O吗?
谢谢! |
S*********s 发帖数: 304 | 2
可以。但很多实验室都是要老鼠,看表型
try TALEN
【在 C********4 的大作中提到】 : 看了一下做K/O老鼠的流程 : 疑问: : 1 要获得K/O ES细胞系,为什么要先得到K/O老鼠,再分离inner cell mass啊?不 : 能直接在ES细胞里面K/O了,直接用于实验吗? : 2 能在一般的细胞系里面直接做K/O吗? : 谢谢!
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C********4 发帖数: 308 | 3 用TALEN是可以
但是
用老鼠基因敲除的targeting construct不能用在普通细胞系吗
【在 S*********s 的大作中提到】 : : 可以。但很多实验室都是要老鼠,看表型 : try TALEN
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C**S 发帖数: 522 | 4 You will get heterozygous KO cell.
【在 C********4 的大作中提到】 : 用TALEN是可以 : 但是 : 用老鼠基因敲除的targeting construct不能用在普通细胞系吗
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s******y 发帖数: 28562 | 5 非常难,因为即使是KO 一个copy 就足够难的了,要两个染色体上的copy
同时被KO的几率是小之又小
【在 C********4 的大作中提到】 : 用TALEN是可以 : 但是 : 用老鼠基因敲除的targeting construct不能用在普通细胞系吗
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h******y 发帖数: 351 | 6 For the second question, the answer is Yes we can. There are several ways
to achieve this - Meganuclease such as ZFN or TALEN, or homologous rAAV
recombination.
Both ZFN and TALEN can make incisions on the chromosome DNA and then employ
non-homologous end-joining repair, which normally result in small deletion
in the endogenous loci to achieve knockout effect. But it is difficult to
knockin. For ZFN or TALEN, the biggest concern is off-target effect due to
the nature of these technologies.
rAAV can introduce very large number of single strand DNA into one cell, and
this presumably increases the chance of homologous recombination. Using
rAAV, it is relatively easier to make knockin than ZFN or TALEN. Of course,
you only get heterozygous deletion after one round, and can achieve
homologous deletion if you do a second round, which has a lower efficiency (
<50% in theory) than first round. |
s********r 发帖数: 312 | 7 TALENs是最好的,如果转染效率还可以的话,homozygous的克隆不难拿到。AAV的话好
处是转染效率高,但是实验室自己做病毒拿不到那么高的titer,那个纯化的kit也不便
宜,跟公司送过来的比titer差远了。 |
H****N 发帖数: 997 | 8 There are two ways to get null es cells with traditional targeting method.
The first is to increase the drug concentration for the positive selection
marker (e.g. Neo). The second, which may be easier, is to use two positive
selection markers, but you will have to make two trageting constructs. |
u**********d 发帖数: 573 | 9 正如楼上们所说,要拿到-/-的细胞,可靠的方法就是两轮转染筛选,这还是一个费时
费力的活的。还没有用过talen系统。
ES细胞系在传代过程中会因为压力小逐渐含有一些genome的变异,包括染色体的
deletion,translocation和aneuploid非整倍体,而两轮的克隆筛选很可能会得到一个
不正常的ES系,光做核型分析还是不够的。
希望KO是ES表型变化的唯一原因,必须rescue实验。
很多KO可能对ES的维持是没太多影响的,起作用是在分化阶段,要用in vitro方法分析
就需要建立不同的分化体系。
用+/- 老鼠配对就反而显得简单了,得到的ICM基本都是没有大的genome缺陷的,-/-的
表型也很好观测了。
【在 C********4 的大作中提到】 : 看了一下做K/O老鼠的流程 : 疑问: : 1 要获得K/O ES细胞系,为什么要先得到K/O老鼠,再分离inner cell mass啊?不 : 能直接在ES细胞里面K/O了,直接用于实验吗? : 2 能在一般的细胞系里面直接做K/O吗? : 谢谢!
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w********r 发帖数: 1431 | 10 talen效率很高的,ko双链问题不大
【在 s******y 的大作中提到】 : 非常难,因为即使是KO 一个copy 就足够难的了,要两个染色体上的copy : 同时被KO的几率是小之又小
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