j****x
发帖数: 1704 | 1 正在折腾一个bicistronic vector for in vivo，前后的ORF齐活了，但中间linker
的选择上犯嘀咕啦。
最普通的基本结构：
Tissue-specific promoter + ORF1(membrane protein) + (IRES/2A) + ORF2(nuclear
protein) + pA
困惑在于，前面ORF1膜蛋白（没有信号肽）而后面ORF2偏是个核蛋白（核定位机制不明
）。用2A的话，一是担心2A残留序列会对功能有影响，二是担心in vivo下引发针对2A
peptide的细胞免疫，三是担心前面的膜蛋白表达可能会对后面核蛋白的定位产生影响。
IRES没有了前两个担心，但是体内的表达水平很难保证，手头也没有现成的商业化载体
（哪位能给推荐一个？）。
简单翻看了之前版上的诸多讨论，还是很难抉择。请诸位经验丰富的先行者给支支招吧
。谢谢！ |
t******k
发帖数: 599 | 2 弱弱的说2a不是被切掉的么，怎么会有残留序列。。。。 |
e***o
发帖数: 344 | 3 如果担心2A的话。就用ires好了。其实还好。把小蛋白/容易表达的放在后面就是了。
用过ires-gfp，觉得还可以。 |
j****x
发帖数: 1704 | 4 co-translational 'cleavage' 其实本质上是ribosome skipping，在特定位点（2A上
倒数两位G/P之间）上不等正常的肽键形成就跳至下一个codon，从而形成两个独立的蛋
白。
【在 t******k 的大作中提到】
: 弱弱的说2a不是被切掉的么，怎么会有残留序列。。。。
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j****x
发帖数: 1704 | 5 IRES的序列和后面ATG的位置据说对表达很关键，眼下手边没有任何商业化的载体，心
里不是很有谱。你这个ires-gfp是根据哪个原始载体设计的呢？另外，ires和前面一个
基因的stop codon离得有多远，这个有影响不？
谢啦
【在 e***o 的大作中提到】
: 如果担心2A的话。就用ires好了。其实还好。把小蛋白/容易表达的放在后面就是了。
: 用过ires-gfp，觉得还可以。
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l******g
发帖数: 1623 | 6 http://www.clontech.com/US/Products/Fluorescent_Proteins_and_Re
【在 j****x 的大作中提到】
: IRES的序列和后面ATG的位置据说对表达很关键，眼下手边没有任何商业化的载体，心
: 里不是很有谱。你这个ires-gfp是根据哪个原始载体设计的呢？另外，ires和前面一个
: 基因的stop codon离得有多远，这个有影响不？
: 谢啦
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T*****u
发帖数: 3257 | 7 实践证明不是每次都能被切掉。。。
【在 t******k 的大作中提到】
: 弱弱的说2a不是被切掉的么，怎么会有残留序列。。。。
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d**l
发帖数: 1546 | 8 买一个载体吧。 还是值得的
【在 j****x 的大作中提到】
: IRES的序列和后面ATG的位置据说对表达很关键，眼下手边没有任何商业化的载体，心
: 里不是很有谱。你这个ires-gfp是根据哪个原始载体设计的呢？另外，ires和前面一个
: 基因的stop codon离得有多远，这个有影响不？
: 谢啦
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s******s
发帖数: 13035 | 9 不是2A被切“掉”，而是被切一刀。
前面那个蛋白C段会多一串，后面那个蛋白N段不记得是干净的还是多
几个aa, 反正如果影响定位的话确实很麻烦
【在 t******k 的大作中提到】
: 弱弱的说2a不是被切掉的么，怎么会有残留序列。。。。
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j****x
发帖数: 1704 | 10 前面那个蛋白C端多N-1个aa（N是2A的全长，18-20aa吧大概），后面那个N端多一个P
http://www.biomedcentral.com/1741-7007/6/40
这篇paper也是设计成前一个膜定位后一个核定位，不过前者没有跨膜区，单纯靠N-
Myristoylation来定位，不是很说明问题。
确实很想试试2A的水，纠结啊。。。
【在 s******s 的大作中提到】
: 不是2A被切“掉”，而是被切一刀。
: 前面那个蛋白C段会多一串，后面那个蛋白N段不记得是干净的还是多
: 几个aa, 反正如果影响定位的话确实很麻烦
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C***2
发帖数: 62 | 11 several articles use 2A peptide as linker to generate transgenic animals,
so, I think that 2A can not induce immune response. Please refer the
following papers.
http://www.biomedcentral.com/1741-7007/6/40
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.00
nuclear
2A
响。
【在 j****x 的大作中提到】
: 正在折腾一个bicistronic vector for in vivo，前后的ORF齐活了，但中间linker
: 的选择上犯嘀咕啦。
: 最普通的基本结构：
: Tissue-specific promoter + ORF1(membrane protein) + (IRES/2A) + ORF2(nuclear
: protein) + pA
: 困惑在于，前面ORF1膜蛋白（没有信号肽）而后面ORF2偏是个核蛋白（核定位机制不明
: ）。用2A的话，一是担心2A残留序列会对功能有影响，二是担心in vivo下引发针对2A
: peptide的细胞免疫，三是担心前面的膜蛋白表达可能会对后面核蛋白的定位产生影响。
: IRES没有了前两个担心，但是体内的表达水平很难保证，手头也没有现成的商业化载体
: （哪位能给推荐一个？）。
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S*********s
发帖数: 304 | 12 可以选一个有两个promoter的vector的
或者找一个病毒载体，把上面的selection marker去掉，原来的MCS放你的基因。
这样就没有这个问题了。
nuclear
2A
响。
【在 j****x 的大作中提到】
: 正在折腾一个bicistronic vector for in vivo，前后的ORF齐活了，但中间linker
: 的选择上犯嘀咕啦。
: 最普通的基本结构：
: Tissue-specific promoter + ORF1(membrane protein) + (IRES/2A) + ORF2(nuclear
: protein) + pA
: 困惑在于，前面ORF1膜蛋白（没有信号肽）而后面ORF2偏是个核蛋白（核定位机制不明
: ）。用2A的话，一是担心2A残留序列会对功能有影响，二是担心in vivo下引发针对2A
: peptide的细胞免疫，三是担心前面的膜蛋白表达可能会对后面核蛋白的定位产生影响。
: IRES没有了前两个担心，但是体内的表达水平很难保证，手头也没有现成的商业化载体
: （哪位能给推荐一个？）。
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j****x
发帖数: 1704 | 13 对于transgenic animals，该序列在germline就已经存在了，自然就被识别为自身抗原
而不会引起免疫反应。不是transgenic的话，比如我要先用病毒载体，那么免疫反应就
是一个没法回避的问题了。
【在 C***2 的大作中提到】
: several articles use 2A peptide as linker to generate transgenic animals,
: so, I think that 2A can not induce immune response. Please refer the
: following papers.
: http://www.biomedcentral.com/1741-7007/6/40
: http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.00
:
: nuclear
: 2A
: 响。
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j****x
发帖数: 1704 | 14 这确实是一个办法，不过我要用的其中一个载体，没法这么弄，所以才考虑用一个
cassette搞定所有
【在 S*********s 的大作中提到】
: 可以选一个有两个promoter的vector的
: 或者找一个病毒载体，把上面的selection marker去掉，原来的MCS放你的基因。
: 这样就没有这个问题了。
:
: nuclear
: 2A
: 响。
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f**u
发帖数: 346 | 15 两个都做吧，再加上不同的前后顺序，一共四个construct，
也就是一些克隆而已，工作量没增加多少吧
nuclear
2A
响。
【在 j****x 的大作中提到】
: 正在折腾一个bicistronic vector for in vivo，前后的ORF齐活了，但中间linker
: 的选择上犯嘀咕啦。
: 最普通的基本结构：
: Tissue-specific promoter + ORF1(membrane protein) + (IRES/2A) + ORF2(nuclear
: protein) + pA
: 困惑在于，前面ORF1膜蛋白（没有信号肽）而后面ORF2偏是个核蛋白（核定位机制不明
: ）。用2A的话，一是担心2A残留序列会对功能有影响，二是担心in vivo下引发针对2A
: peptide的细胞免疫，三是担心前面的膜蛋白表达可能会对后面核蛋白的定位产生影响。
: IRES没有了前两个担心，但是体内的表达水平很难保证，手头也没有现成的商业化载体
: （哪位能给推荐一个？）。
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P****o
发帖数: 172 | 16 如果在载体递送后很短的时间内（不超过10天？）观察表型，应该没有太大的问题。
【在 j****x 的大作中提到】
: 对于transgenic animals，该序列在germline就已经存在了，自然就被识别为自身抗原
: 而不会引起免疫反应。不是transgenic的话，比如我要先用病毒载体，那么免疫反应就
: 是一个没法回避的问题了。
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j****x
发帖数: 1704 | 17 确实，还是都试一下做个对比比较保险
先后顺序因为特殊原因是不能变动了，但是对IRES序列我选择了2种不同的类型和设计
，希望至少有一个能满意吧
谢谢建议
【在 f**u 的大作中提到】
: 两个都做吧，再加上不同的前后顺序，一共四个construct，
: 也就是一些克隆而已，工作量没增加多少吧
:
: nuclear
: 2A
: 响。
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j****x
发帖数: 1704 | 18 我们需要相对较长的一段观察时期，10天肯定不够。所以目前打算先用
immunodeficient mice尝试一下，如果靠谱就迅速转向transgenic mice。
【在 P****o 的大作中提到】
: 如果在载体递送后很短的时间内（不超过10天？）观察表型，应该没有太大的问题。
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P****o
发帖数: 172 | 19 如果你的target 细胞是hematopoitic stem cell来源的，也可以试一下HSC
transduciton, 再转到irradiated rag-/- 老鼠。
【在 j****x 的大作中提到】
: 我们需要相对较长的一段观察时期，10天肯定不够。所以目前打算先用
: immunodeficient mice尝试一下，如果靠谱就迅速转向transgenic mice。
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