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发帖数: 28450 | 1 【 以下文字转载自 WaterWorld 讨论区 】
发信人: monolith (on the road), 信区: WaterWorld
标 题: [请转生物版（第一天注册，只能发水版)问题急求] IP 问题，各位大牛请进
关键字: 生物版 IP问题
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Apr 24 10:56:49 2013, 美东)
做一个Co-IP实验，检测骨架蛋白plectin(>500KD)与一个GTPase（A）的相互作用。内
源plectin,高表达A(A-flag)或 dominant negative A (DN-A-flag)。用plectin单抗做
IP，anti-flag blot 显示A-flag可以被co-IP下来，同样的co-IP GFP-negative
control 背景比较干净，而co-IP DN-A-flag有微弱信号（约为A-flag 的1/10）。
用做IP同样的antibody blot plectin,input 部分一切正常，显示相同的内源plectin;
问题出在 straight IP部分，同样的抗体同时blot同一块胶上的IP部分，没有任何信号
show out。这一结果已至少重复3次（重复性很好）。
考虑到plectin分子量巨大，试过不同的gel concentration 和transfer time。但始终
不能解决这一问题。
其它可能情况：
1. plectin与A相互作用后translocation 到膜结构中,导致常规lysis buffer不能裂解
，所以IP part没有信号？
2. 形成复杂结构且resistant to SDS? 很难make sense.
3.......
不知描述是否清楚。请问诸位是否遇到过类似问题？没有的话大家讨论一下what
happened? 谢谢 |
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