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Biology版 - qPCR检测到Ct值在32左右的基因用western检测到蛋白会有多强?
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请问影响real-time qPCR扩增效率的因素?急问QPCR引物efficiency在不同细胞系怎么不一样?
【包子求助】大家怎么做单细胞 qTR-PCR 的啊?求助一个qPCR计算基因拷贝数出现在的诡异问题
请教PCR问题请问real-time PCR negative control的Ct值的问题
GAPDH的Ct值在30以上,这结果还可靠不?比较不同基因在同一和不同细胞系中的表达量————qPCR结果要怎样分析
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话题: ct话题: 蛋白话题: 检测话题: qpcr话题: pcr
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l**********t
发帖数: 138
1
有经验的请说说。
谢了!
s****9
发帖数: 932
2
qPCR的Ct值怎么能够预测蛋白浓度,这个取决你放了多少的cDNA还有你的Prime设计
没有人会有经验回答这个问题。

【在 l**********t 的大作中提到】
: 有经验的请说说。
: 谢了!

M*****n
发帖数: 16729
3
cDNA abundance和 protein abundance 没有直接correlation.
l**********t
发帖数: 138
4
同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右,18s在12左右,我觉得蛋白表达应该不会很强
z*******6
发帖数: 679
5
18s为啥这么高的Ct...

【在 l**********t 的大作中提到】
: 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右,18s在12左右,我觉得蛋白表达应该不会很强
s******y
发帖数: 28562
6
不同的primer 之间不能直接比较的。
而且,RNA 的量和蛋白的量不是一回事。有些蛋白RNA虽然多,但是蛋白降解得快,正
常情况下含量也不高

【在 l**********t 的大作中提到】
: 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右,18s在12左右,我觉得蛋白表达应该不会很强
y****i
发帖数: 2194
7
如果你gapdh在16左右,目标蛋白在32,95%以上的机会你直接做western是看不到蛋白的
这么说吧 ct值低 不代表你一定能检测到蛋白(由于其他人谈到的各种primer,蛋白降
解等等原因)
但是ct值高于30了,基本可以代表你用straight wetern检测不到蛋白
但如果你可以先IP,或者用其他的方法enrich你的蛋白 还是有可能的

【在 l**********t 的大作中提到】
: 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右,18s在12左右,我觉得蛋白表达应该不会很强
a*******a
发帖数: 4233
8
完全可能检测到
蛋白降解速度不确定.
抗体效价不确定
这些都是影响wb的重要条件
我们有做gapdh ct15, candidate32-34的一个基因
D****g
发帖数: 275
9
总结一下,有80%的可能性检测不到,20%的可能性监测到。
m****M
发帖数: 360
10
CT值和蛋白表达量没有直接的关系。以上各位哥们都说了。
还有一点,CT值和PCR扩增效率的关系。同一个基因,用不同的引物扩增,都能差几个
CT。也就是说,引物设计的不好,扩增效率差,你CT值会很大。扩增效率好的引物,扩
增效率好,信号强,CT值就小。
另外,你如果用SYBGREEN的话,扩增片段的长短也会影响信号的强弱,从而影响CT值。
300bp的和150bp的同样扩增效率的引物,CT值会差别很大。
l**********t
发帖数: 138
11
回复上面提到的
我用两对不同的primer检测,产物都在100bp左右,用的是SYBRGREEN,Ct值差不多都在
32左右
m****M
发帖数: 360
12
我断断续续做了将近10年的qRT-PCR,尤其是后来在一个实验室几乎每天就做这个,
而且是大量筛选。从表达文库挑出基因,设计引物,专个用qRT-PCR进行再次对文库中
有差别的进行一个一个验证。主要检测小RNA和mRNA的表达分析。,做了将近3年,几
乎可以说什么样的情况都遇到过(有点自吹,请不要拍砖)。
有时对一个基因很感兴趣,出来qPCR结果和文库不一样,或一样但是表达量上有差异。
同一个基因,在不同位置设计引物和所扩增片段大小,对qRT-PCR CT value来说都都很
有讲究。有时一个基因有不同的isoform,如果没有注意到这些,就会失去很多的发现
,甚至几篇文章。有时间了我准备写个关于QRT-PCR的BLOG共大家分享。

【在 l**********t 的大作中提到】
: 回复上面提到的
: 我用两对不同的primer检测,产物都在100bp左右,用的是SYBRGREEN,Ct值差不多都在
: 32左右

a*****n
发帖数: 2835
13
western blot depends too much on a good antibody.

【在 l**********t 的大作中提到】
: 回复上面提到的
: 我用两对不同的primer检测,产物都在100bp左右,用的是SYBRGREEN,Ct值差不多都在
: 32左右

q***7
发帖数: 144
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如果用SybrGreen,30个cycle以后的我基本都不考虑,跑个胶看看你就知道,那基本
上是引物二聚体.
上面那个仁兄说的对,可以适当增加点PCR长度,我有时用400bp左右,因为结合较
多的dye可以得到非常好的信号

【在 l**********t 的大作中提到】
: 回复上面提到的
: 我用两对不同的primer检测,产物都在100bp左右,用的是SYBRGREEN,Ct值差不多都在
: 32左右

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