L*****t
发帖数: 56 | 1 想要研究某个蛋白的功能，HepG2里有这个蛋白完整的代谢通路但是这个蛋白本身也有
表达。现在想敲除本底表达后用Flp-FRT引入突变体。只是单纯的敲除，TALEN和CRISPR
哪一个更合适？ |
g****0
发帖数: 425 | 2 co-ask!
CRISPR
【在 L*****t 的大作中提到】
: 想要研究某个蛋白的功能，HepG2里有这个蛋白完整的代谢通路但是这个蛋白本身也有
: 表达。现在想敲除本底表达后用Flp-FRT引入突变体。只是单纯的敲除，TALEN和CRISPR
: 哪一个更合适？
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s*****g
发帖数: 87 | 3 用TALEN吧，敲除单个基因的话CRISPR没有优势，而且还可能有off-target |
L*****t
发帖数: 56 | 4 谢谢，那我就准备买TALEN的质粒了
【在 s*****g 的大作中提到】
: 用TALEN吧，敲除单个基因的话CRISPR没有优势，而且还可能有off-target
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d****i
发帖数: 2346 | 5 我也不了解，但是看文章说CRISPR的off target远远低于前者。。 |
s*****g
发帖数: 87 | 6 不太可能，CRISPR的特异识别序列只有14bp，很容易target到其他genomic region
TALEN的特异识别序列有30-60bp,远远高于CRISPR |
h******y
发帖数: 351 | 7 用TALEN和ZFN的话off target的可能性也是有的。TALEN单侧靶位点一般设计16-18个碱
基，但是由于任何一个TALEN domain对相邻TALEN domain与靶碱基的结合是有影响的，
所以TALEN是可能结合到imperfect match的位点上去的。
由于TALEN的设计要在蛋白质水平进行，可以想象合成4^16种TALEN蛋白，从而对TALEN与
靶位点之间的特异性结合进行完全充分的研究是不可能的。所以实际上还没有文章像CR
ISPER那样对TALEN靶位点的每个碱基的重要性进行过系统的研究。相反，CRISPER只需要
合成oligo，单个碱基的突变很容易实现，所以能发现前面12-14个碱基最重要。但是这
并不等于说CRISPER只需要12-14个碱基，只是其余碱基的重要性相对较低而已。
【在 s*****g 的大作中提到】
: 不太可能，CRISPR的特异识别序列只有14bp，很容易target到其他genomic region
: TALEN的特异识别序列有30-60bp,远远高于CRISPR
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s********x
发帖数: 472 | 8 我个人倾向于crispr ， 速度比talen快很多 ， 不用合成那些dna repeats。
说到突变，细胞培养的突变恐怕更多，而且也没有那么巧就影响实验。
我做遗传，用enu ems 化学诱变 背景突变不知道多少，还不是一样分析。 |
d****i
发帖数: 2346 | 9
按照碱基的长度看的话确实是CRISPR稍微差一点。我主要是看了Qi的那篇cell文章，他
们用了RFP作为target，也可能是RFP在细菌和细胞内本身就是一个外源基因，内源
genomic DNA里面同源的序列比较少或没有，，因此看起来特异性就高了很多。
【在 s*****g 的大作中提到】
: 不太可能，CRISPR的特异识别序列只有14bp，很容易target到其他genomic region
: TALEN的特异识别序列有30-60bp,远远高于CRISPR
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s*****g
发帖数: 87 | 10 TALENs function in pairs，所以总的识别长度要乘以2，非常的长，即使有的RVD特异
性不够高，但也基本上不可能有off-target effect
TALEN与
CR
需要
【在 h******y 的大作中提到】
: 用TALEN和ZFN的话off target的可能性也是有的。TALEN单侧靶位点一般设计16-18个碱
: 基，但是由于任何一个TALEN domain对相邻TALEN domain与靶碱基的结合是有影响的，
: 所以TALEN是可能结合到imperfect match的位点上去的。
: 由于TALEN的设计要在蛋白质水平进行，可以想象合成4^16种TALEN蛋白，从而对TALEN与
: 靶位点之间的特异性结合进行完全充分的研究是不可能的。所以实际上还没有文章像CR
: ISPER那样对TALEN靶位点的每个碱基的重要性进行过系统的研究。相反，CRISPER只需要
: 合成oligo，单个碱基的突变很容易实现，所以能发现前面12-14个碱基最重要。但是这
: 并不等于说CRISPER只需要12-14个碱基，只是其余碱基的重要性相对较低而已。
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h******y
发帖数: 351 | 11 理论上当然是这样，但是两个TALEN可以形成三种二聚体（AA,AB,BB)，在极端条件下，
一端位点强结合，另一端弱结合也能造成Off-Target的剪切。
【在 s*****g 的大作中提到】
: TALENs function in pairs，所以总的识别长度要乘以2，非常的长，即使有的RVD特异
: 性不够高，但也基本上不可能有off-target effect
:
: TALEN与
: CR
: 需要
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s*****g
发帖数: 87 | 12 你说的很对。 不过已经报道了通过引入FokI突变体可以彻底避免 AA, BB的形成，大大
降低off-target effect
【在 h******y 的大作中提到】
: 理论上当然是这样，但是两个TALEN可以形成三种二聚体（AA,AB,BB)，在极端条件下，
: 一端位点强结合，另一端弱结合也能造成Off-Target的剪切。
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 mark.
【在 s*****g 的大作中提到】
: 你说的很对。 不过已经报道了通过引入FokI突变体可以彻底避免 AA, BB的形成，大大
: 降低off-target effect
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g*********5
发帖数: 2533 | |
s*****g
发帖数: 87 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 16 Mark again and thx.
--from FDU Alumni
发信人: giantbird05 (大鸟), 信区: Biology
标 题: Re: 想在HepG2细胞系里敲除一个基因，用TALEN还是CRISPR容易？
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 26 01:39:25 2013, 美东)
mark;求科普
【在 s*****g 的大作中提到】
: Heterodimeric TALEN, 请参见
: http://nar.oxfordjournals.org/content/40/16/8001.short
: 关于TALEN technology, 有兴趣的可以看看最新的两篇review
: http://www.nature.com/nrm/journal/v14/n1/abs/nrm3486.html
: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.24890/abstract;j
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