C**S
发帖数: 522 | 1 图片是U2Os GFP－LC3细胞，还没有给予starvation。以这个图为例，有很多问题，一
一求教
1：如何定量。大家用软件还是手动数，软件的话有什么软件推荐？
2：还是定量问题：看到说autophagosome大小在0.5－1.5uM，照片上的很多小点是小于
这一值的，是不是只数大于0.5uM的？
3： 怎么解决heterogeneity的问题。看autophagy文章error bar都很小。怎么培养细
胞才能减少对照细胞的autophagy？ 同样的问题在starve之后也存在。
4：细胞在EBSS里starve6小时，也没看见GFP puncta明显增加，是不是有什么没有注意
到的问题？还是在这个荧光定量的实验中，大家都是默认加inhibitor的比如bafA1，即
使实验方法中没有明确说明？
预先感谢大家能够一一解答。 | s*****g
发帖数: 7857 | 2 木有阳性对照啊!
定量用软件好吧
实在不行就看WB的LC-3B cleavage
荧光定量的实验应该是Semi-quanitive
inhibitor有很多,对autophagy不同阶段有抑制.所以要选好.
Acridine Orange荧光染色,可以用
micro-palte reader(定量)
flow cytometry(定量)
荧光micorscope (image)
另外knockdown Atg7/5等表达,在看autophagy在同样处理下发不发生
【在 C**S 的大作中提到】
: 图片是U2Os GFP－LC3细胞，还没有给予starvation。以这个图为例，有很多问题，一
: 一求教
: 1：如何定量。大家用软件还是手动数，软件的话有什么软件推荐？
: 2：还是定量问题：看到说autophagosome大小在0.5－1.5uM，照片上的很多小点是小于
: 这一值的，是不是只数大于0.5uM的？
: 3： 怎么解决heterogeneity的问题。看autophagy文章error bar都很小。怎么培养细
: 胞才能减少对照细胞的autophagy？ 同样的问题在starve之后也存在。
: 4：细胞在EBSS里starve6小时，也没看见GFP puncta明显增加，是不是有什么没有注意
: 到的问题？还是在这个荧光定量的实验中，大家都是默认加inhibitor的比如bafA1，即
: 使实验方法中没有明确说明？
| C**S
发帖数: 522 | 3 非常感谢你提供这么多信息。
【在 s*****g 的大作中提到】
: 木有阳性对照啊!
: 定量用软件好吧
: 实在不行就看WB的LC-3B cleavage
: 荧光定量的实验应该是Semi-quanitive
: inhibitor有很多,对autophagy不同阶段有抑制.所以要选好.
: Acridine Orange荧光染色,可以用
: micro-palte reader(定量)
: flow cytometry(定量)
: 荧光micorscope (image)
: 另外knockdown Atg7/5等表达,在看autophagy在同样处理下发不发生
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