b*********8
发帖数: 44 | 1 最近想过表达一个21-22nt的miRNA,
1. 请问对于一般这个miRNA 与目标序列有多上个碱基完全匹配才能完全有效？4个碱基
错配会不会有效？
2. 一般要表达多长miRNA？只表达stem loop区段够不够？
谢谢！ | X***n
发帖数: 366 | 2 一般来说2-7位最重要，不能有任何错配，3‘端最不重要。但具体每个microRNA不同的
，有的3'端很重要，不能有突变。
加上stem-loop上下游各200bp最好。 | d*p
发帖数: 534 | 3 能不能直接把STEM-LOOP像shRNA 一样表达？ | w***a
发帖数: 432 | 4 这片文章里有讲过一点。和shRNA一样表达。
@Article{Chen2004,
Title = {MicroRNAs modulate hematopoietic lineage
differentiation.},
Author = {Chang-Zheng Chen and Ling Li and Harvey F
Lodish and David P Bartel},
Journal = {Science},
Year = {2004},
Month = {Jan},
Note = {mark},
Number = {5654},
Pages = {83--86},
Volume = {303},
Abstract = {MicroRNAs (miRNAs) are an abundant class of
approximately 22-nucleotide regulatory RNAs found in plants and animals.
Some miRNAs of plants, Caenorhabditis elegans, and Drosophila play important
gene-regulatory roles during development by pairing to target mRNAs to
specify posttranscriptional repression of these messages. We identify three
miRNAs that are specifically expressed in hematopoietic cells and show that
their expression is dynamically regulated during early hematopoiesis and
lineage commitment. One of these miRNAs, miR-181, was preferentially
expressed in the B-lymphoid cells of mouse bone marrow, and its ectopic
expression in hematopoietic stem/progenitor cells led to an increased
fraction of B-lineage cells in both tissue-culture differentiation assays
and adult mice. Our results indicate that microRNAs are components of the
molecular circuitry that controls mouse hematopoiesis and suggest that other
microRNAs have similar regulatory roles during other facets of vertebrate
development.},
Comment = {mark},
Doi = {10.1126/science.1091903},
File = {Chen2004.pdf:Chen2004.pdf:PDF},
Institution = {Whitehead Institute for Biomedical Research,
Nine Cambridge Center, Cambridge, MA 02142, USA.},
Keywords = {Animals; B-Lymphocytes, cytology/metabolism;
Blotting, Northern; Bone Marrow Cells, metabolism; Bone Marrow
Transplantation; Cell Differentiation; Cell Lineage; Genetic Vectors;
Hematopoiesis; Hematopoietic Stem Cells, cytology/metabolism; Lymphopoiesis;
Mice; Mice, Inbred C57BL; Mice, Inbred Strains; MicroRNAs, genetics/
physiology; Spleen, metabolism; T-Lymphocytes, cytology/metabolism; Thymus
Gland, metabolism},
Language = {eng},
Medline-pst = {ppublish},
Owner = {wen},
Pii = {1091903},
Pmid = {14657504},
Timestamp = {2010.09.06},
Url = {http://dx.doi.org/10.1126/science.1091903}
} | b*********8
发帖数: 44 | 5 谢谢各位的回复。
我没有做miRNA的经验。我自己想合成一段miRNA,大约300bp,包含stem-loop序列和上下
游各100bp,然后把他克隆到带有启动子和终止子的bianary vector中用于过表达，这样
可以吗？
To Xiren:
一般来说2-7位最重要，不能有任何错配，3‘端最不重要。这里说的2-7位是针对miRNA
序列来说的吧，不是针对目标序列把？请问能推荐一下参考文献吗？
非常感谢！ | a*******o
发帖数: 16 | 6 一般直接模仿miRNA在体内biogenesis的过程吧，在genome上找到pre-miR的sequence，
然后在5'和3’各加100bp左右的flank region， 这样貌似表达效率会比较高。 | c********b
发帖数: 363 | 7 你得说是植物的还是动物的，完全不同的设计。
动物的我不懂，植物的用下面这个网站设计。
http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi?page=Designer;pr
【在 b*********8 的大作中提到】
: 最近想过表达一个21-22nt的miRNA,
: 1. 请问对于一般这个miRNA 与目标序列有多上个碱基完全匹配才能完全有效？4个碱基
: 错配会不会有效？
: 2. 一般要表达多长miRNA？只表达stem loop区段够不够？
: 谢谢！
| b*********8
发帖数: 44 | 8 感谢回复！
我做的是植物的。 我现在想过表达一个miRNA, 已经知道他的stem-loop序列，也blast
到了他的部分genome序列，但没找到cDNA序列。我如果直接根据genome序列，在这段
stem-loop序列两边各加上100bp边界序列做过表达，可以吗？我担心这段边界序列不会
正好在intron区吧,会不会影响发夹结构的形成？ | c********b
发帖数: 363 | 9 看样子你是想了解过表达一个miRNA的功能而不是用miRNA去down regulate一个基因来
看表型。
一般不太可能找到cDNA，因为太短了，一般用kit提RNA时都被去掉了，除非专门做的小
RNA（18-120 nt) 的EST.
很简单，你延伸两边各100nt，然后用mFOLD看看还是不是一个stem-loop，如果是就直
接用，不是就trim掉不是的那一部分。
blast
【在 b*********8 的大作中提到】
: 感谢回复！
: 我做的是植物的。 我现在想过表达一个miRNA, 已经知道他的stem-loop序列，也blast
: 到了他的部分genome序列，但没找到cDNA序列。我如果直接根据genome序列，在这段
: stem-loop序列两边各加上100bp边界序列做过表达，可以吗？我担心这段边界序列不会
: 正好在intron区吧,会不会影响发夹结构的形成？
| b*********8
发帖数: 44 | 10 非常感谢 centuribob 的回复！我是想一起过表达miRNA和预测的target gene, 来看有
何表型。 | c********b
发帖数: 363 | 11 。。。你这样最多验证有没有调控，表型是很难看到的。
【在 b*********8 的大作中提到】
: 非常感谢 centuribob 的回复！我是想一起过表达miRNA和预测的target gene, 来看有
: 何表型。
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