b******9
发帖数: 425 | 1 做了个construct，转primary newborn astrocytes，用hygromycin来筛选stable
transfection，可是一直都没有筛出来，细胞全都死光光了。转染效率还算可以，是电
转，有30%左右。hygromycin浓度也不算高，50ug/ml。
hygromycin是用TK promoter表达的，不知道是不是因为promoter不行。试了别人的一
个puromycin construct，是pGK promoter，也基本上死光了。想问一问版上牛人有没
有经验可以传授。多谢多谢！
另外我是用CMV promoter来表达我要的基因，先转细胞，然后筛选stable line打到老
鼠上。听说CMV promoter在体内可能会被shut down，是不是也应该换掉呢？谢谢！ |
b******9
发帖数: 425 | 2 顶一下。
【在 b******9 的大作中提到】
: 做了个construct，转primary newborn astrocytes，用hygromycin来筛选stable
: transfection，可是一直都没有筛出来，细胞全都死光光了。转染效率还算可以，是电
: 转，有30%左右。hygromycin浓度也不算高，50ug/ml。
: hygromycin是用TK promoter表达的，不知道是不是因为promoter不行。试了别人的一
: 个puromycin construct，是pGK promoter，也基本上死光了。想问一问版上牛人有没
: 有经验可以传授。多谢多谢！
: 另外我是用CMV promoter来表达我要的基因，先转细胞，然后筛选stable line打到老
: 鼠上。听说CMV promoter在体内可能会被shut down，是不是也应该换掉呢？谢谢！
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a****d
发帖数: 1919 | |
h******y
发帖数: 351 | 4 Hygromycin浓度偏高了。你有没有先做一下kill curve找出合适的antibiotic浓度？
合适的hygromycin通常在10-30 ug/mL
合适的puromycin通常在0.3-1 ug/mL
【在 b******9 的大作中提到】
: 做了个construct，转primary newborn astrocytes，用hygromycin来筛选stable
: transfection，可是一直都没有筛出来，细胞全都死光光了。转染效率还算可以，是电
: 转，有30%左右。hygromycin浓度也不算高，50ug/ml。
: hygromycin是用TK promoter表达的，不知道是不是因为promoter不行。试了别人的一
: 个puromycin construct，是pGK promoter，也基本上死光了。想问一问版上牛人有没
: 有经验可以传授。多谢多谢！
: 另外我是用CMV promoter来表达我要的基因，先转细胞，然后筛选stable line打到老
: 鼠上。听说CMV promoter在体内可能会被shut down，是不是也应该换掉呢？谢谢！
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n***w
发帖数: 2405 | 5 re. pax2 as well.
【在 a****d 的大作中提到】
: S100beta or GFAP?
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