c****1
发帖数: 1095 | 1 我们组是做neuronal activity调节基因表达的。最近做的一个蛋白，我们认为它可以
调节 neuronal activity dependent gene expression. ChIP data也提示我们的想法
可能是对的。因为这个蛋白有 neuronal activity dependent enrichment，而且还主
要在比如Arc，fos这些基因的promoter。
现在的问题是，把这个蛋白敲掉后（大概70%），ChIP data显示，enrichment显著降低
。但是，那些 targeted neuronal activity dependent genes没有显著变化（在
neuron去极化后）。
请问，还有什么方向可以摸索么？ |
A**r
发帖数: 43 | 2 你的意思是，这个蛋白在depolarization之后会被recruit到Arc和Fos的promoter，
但是敲掉之后，Arc和Fos的mRNA level没有变化？
有没有类似功能的蛋白可能compensate你的manipulation？
除了ChIP data之外，还有什么证据支持“认为它可以调节neuronal activity
dependent gene expression”？
这个蛋白是DNA-binding或者histone-binding么？跟transcription factor有关？ |
c****1
发帖数: 1095 | 3 你的理解是正确的。
把它同一个家族的其它基因同时敲掉后，也没有什么变化。这个蛋白是可以跟histone
结合的。目前只有ChIP data是阳性的。我们也考虑过这个蛋白的作用可能是先跟
promoter结合但是起的作用是及时关掉相关基因的表达。但是实验结果也不是很显著。
我的问题是，研究activity dependent gene expression，除了可以从开始induction
和后期的 shut down入手外，还有没有别的路径可以考虑？
【在 A**r 的大作中提到】
: 你的意思是，这个蛋白在depolarization之后会被recruit到Arc和Fos的promoter，
: 但是敲掉之后，Arc和Fos的mRNA level没有变化？
: 有没有类似功能的蛋白可能compensate你的manipulation？
: 除了ChIP data之外，还有什么证据支持“认为它可以调节neuronal activity
: dependent gene expression”？
: 这个蛋白是DNA-binding或者histone-binding么？跟transcription factor有关？
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A**r
发帖数: 43 | 4 不知道。。。只能瞎猜了
敲掉这个基因会不会影响histone modification？
如果还是从induction的角度的话，
有没有可能是KCl depolarization的刺激太强了，掩盖了一些细微的变化？没准用
physiology level的stimulation，能看到induction的不同？
有没有可能影响induction的快慢？Arc和c-Fos在几分钟之内就产生mRNA，敲掉这个基
因之后，没准induction变慢了（前十几分钟的mRNA变少），但是一个小时之后测mRNA
，可能看不出啥变化。 |
n***y
发帖数: 114 | 5 你都把基因knockdown了，enrichment当然变低了。我觉得应该测knockdown之后neuron
activity的变化，那些target gene rna 是多久之后测得，就像楼上说的，可能会影
响反应速度的灵敏度。如果是结合histone，能不能测一下histone的修饰。 |
c****1
发帖数: 1095 | 6 前一段时间太忙了，没空来看论坛。今天接着讨论下。
我做了time course，从5min到4hr都做了。这些目的基因的induction的曲线变化不明
显。
你说检测histone的修饰，但是，histone的修饰，最终的readout还是gene 表达的变化
。如果现在看不到表达方面的变化，那检测histone有什么意义呢？
neuron
【在 n***y 的大作中提到】
: 你都把基因knockdown了，enrichment当然变低了。我觉得应该测knockdown之后neuron
: activity的变化，那些target gene rna 是多久之后测得，就像楼上说的，可能会影
: 响反应速度的灵敏度。如果是结合histone，能不能测一下histone的修饰。
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m****m
发帖数: 4741 | 7 not enough kd. try harder.
【在 c****1 的大作中提到】
: 我们组是做neuronal activity调节基因表达的。最近做的一个蛋白，我们认为它可以
: 调节 neuronal activity dependent gene expression. ChIP data也提示我们的想法
: 可能是对的。因为这个蛋白有 neuronal activity dependent enrichment，而且还主
: 要在比如Arc，fos这些基因的promoter。
: 现在的问题是，把这个蛋白敲掉后（大概70%），ChIP data显示，enrichment显著降低
: 。但是，那些 targeted neuronal activity dependent genes没有显著变化（在
: neuron去极化后）。
: 请问，还有什么方向可以摸索么？
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A******u
发帖数: 61 | 8 请问 你的ChIP是在培养的细胞做的吗
什么细胞？
【在 c****1 的大作中提到】
: 我们组是做neuronal activity调节基因表达的。最近做的一个蛋白，我们认为它可以
: 调节 neuronal activity dependent gene expression. ChIP data也提示我们的想法
: 可能是对的。因为这个蛋白有 neuronal activity dependent enrichment，而且还主
: 要在比如Arc，fos这些基因的promoter。
: 现在的问题是，把这个蛋白敲掉后（大概70%），ChIP data显示，enrichment显著降低
: 。但是，那些 targeted neuronal activity dependent genes没有显著变化（在
: neuron去极化后）。
: 请问，还有什么方向可以摸索么？
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c****1
发帖数: 1095 | 9 用的是shRNA，设计了好几个。KD的效率至少有70%。
难道要弄loxP+CRE？ 或者null？
【在 m****m 的大作中提到】
: not enough kd. try harder.
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c****1
发帖数: 1095 | 10 ChIP是在Primary Neuron里做的。
【在 A******u 的大作中提到】
: 请问 你的ChIP是在培养的细胞做的吗
: 什么细胞？
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