g*********5
发帖数: 2533 | 1 我研究的基因是酵母一个基因的同源物。
reviewer想让我转人的基因到knockout的酵母里面，
看能否互补。这个试验难做吗？谢谢。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 2 up Fudan Alumni
Btw, you must ask sunny for this query...
【在 g*********5 的大作中提到】
: 我研究的基因是酵母一个基因的同源物。
: reviewer想让我转人的基因到knockout的酵母里面，
: 看能否互补。这个试验难做吗？谢谢。
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X******n
发帖数: 914 | |
g*********5
发帖数: 2533 | 4 sunny in joke ban, no here :) |
X******n
发帖数: 914 | 5 如果你不关注酵母background的话，可以直接买一个knockout菌株，把你的基因克隆到
一个酵母表达载体（pRS416什么的）里面就可以转化了。 |
a********k
发帖数: 2273 | 6 实验很容易。不出一个月肯定搞定，至于有没有结果另说。
【在 g*********5 的大作中提到】
: 我研究的基因是酵母一个基因的同源物。
: reviewer想让我转人的基因到knockout的酵母里面，
: 看能否互补。这个试验难做吗？谢谢。
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g*********5
发帖数: 2533 | 7 谢谢大家。看到thermo 有现成的敲除的strain卖，就是基因型看得头昏。
Strain Background Genotype
Mat A BY4730 MATa leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
Mat Alpha BY4739 MATalpha leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
Mat A BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
Mat Alpha BY4742 MATalpha his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
Het/Hom Dip BY4743 4741/4742
我要的菌株是Yeast HetDip Knock Out Strain YJR045C
怎么样的平板才能使敲除的菌株不长啊？能买到板吗？ |
T****i
发帖数: 15191 | 8 你要先看 yeast KO 的表型，SGD查一下。如果lethal，只好买het，否则买MATa 或
MATalpha都行。Complementation test 的时候也是一样。如果是lethal，那你需要做
plasmid shuffling/exchange；如果不是lethal，那就好办，直接转目标plasmid 就可
以了。
【在 g*********5 的大作中提到】
: 谢谢大家。看到thermo 有现成的敲除的strain卖，就是基因型看得头昏。
: Strain Background Genotype
: Mat A BY4730 MATa leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
: Mat Alpha BY4739 MATalpha leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
: Mat A BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
: Mat Alpha BY4742 MATalpha his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
: Het/Hom Dip BY4743 4741/4742
: 我要的菌株是Yeast HetDip Knock Out Strain YJR045C
: 怎么样的平板才能使敲除的菌株不长啊？能买到板吗？
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T****i
发帖数: 15191 | 9 补充一下，如果是lethal，het需要先转那个control plasmid （with the yeast
ortholog of your mammalian target) 再sporulate。还有别的策略，一时说不清，最
好周围找个yeast 专家问问。不是lethal，怎么都好办。
【在 g*********5 的大作中提到】
: 谢谢大家。看到thermo 有现成的敲除的strain卖，就是基因型看得头昏。
: Strain Background Genotype
: Mat A BY4730 MATa leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
: Mat Alpha BY4739 MATalpha leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
: Mat A BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
: Mat Alpha BY4742 MATalpha his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
: Het/Hom Dip BY4743 4741/4742
: 我要的菌株是Yeast HetDip Knock Out Strain YJR045C
: 怎么样的平板才能使敲除的菌株不长啊？能买到板吗？
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g*********5
发帖数: 2533 | 10 谢谢，不关注背景，只是看看是不是同源互补。
请详细点说说。
【在 X******n 的大作中提到】
: 如果你不关注酵母background的话，可以直接买一个knockout菌株，把你的基因克隆到
: 一个酵母表达载体（pRS416什么的）里面就可以转化了。
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 why select homo sapiens to observe homology of the gene,
the expression system is Yeast,
the original of that gene is from rodents or other mammals ?
【在 g*********5 的大作中提到】
: 谢谢，不关注背景，只是看看是不是同源互补。
: 请详细点说说。
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g*********5
发帖数: 2533 | 12 This gene is a mammalian gene, I have the human gene at hand. |
l**********1
发帖数: 5204 | 13 why not try that mammal and homo sapiens that gene homologic loci
manipulation?
【在 g*********5 的大作中提到】
: This gene is a mammalian gene, I have the human gene at hand.
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g*********5
发帖数: 2533 | 14 qiu kepu.
【在 l**********1 的大作中提到】
: why not try that mammal and homo sapiens that gene homologic loci
: manipulation?
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g*********5
发帖数: 2533 | 15 pRS416 mcs ?
under the T7 ?
would you please give me a link?
I googled and more confused.
thanks.
【在 X******n 的大作中提到】
: 如果你不关注酵母background的话，可以直接买一个knockout菌株，把你的基因克隆到
: 一个酵母表达载体（pRS416什么的）里面就可以转化了。
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X******n
发帖数: 914 | |
X******n
发帖数: 914 | 17 你的基因是个essential gene。 你买的这个是heterzygous deletion，很多时候这种
deletion没有表型。所以你应该先看看有没有你想要的表型，然后才做互补试验。
如果没有表型，你可以参考上面Tianzi的回复所说的方法，也可以去找找有没有ts
mutant。或者去看看Yeast DAmp Library 或者 TR Hughes 的 TetO7-promoter
mutants library有没有你想要的基因。 |
g*********5
发帖数: 2533 | 18 this gene is not in TR Hughes library but in Damp library.
For Damp library,
haploid or heterozygous diploid formats
which one is better for the experiment?
thanks, baozi.
【在 X******n 的大作中提到】
: 你的基因是个essential gene。 你买的这个是heterzygous deletion，很多时候这种
: deletion没有表型。所以你应该先看看有没有你想要的表型，然后才做互补试验。
: 如果没有表型，你可以参考上面Tianzi的回复所说的方法，也可以去找找有没有ts
: mutant。或者去看看Yeast DAmp Library 或者 TR Hughes 的 TetO7-promoter
: mutants library有没有你想要的基因。
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g*********5
发帖数: 2533 | 19 请问pRS416是什么启动子阿？
谢谢。
【在 X******n 的大作中提到】
: 如果你不关注酵母background的话，可以直接买一个knockout菌株，把你的基因克隆到
: 一个酵母表达载体（pRS416什么的）里面就可以转化了。
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l**********1
发帖数: 5204 | 20 pRS416 excepts T7 also has Plac promoter.
pls refer
PMID 16820502
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16820502
>pRS416 is a centromeric (CEN) plasmid and therefore is maintained at 1 to 2
copies per cell, while pRS426 is a 2μm plasmid, maintained at about 25
copies per cell (36). Both plasmids have the ColE1-derived pBluescript high-
copy origin of replication, a lacZα-associated multicloning site, an
ampicillin resistance gene (bla) for gram-negative bacteria, and a URA3
marker for yeast. These plasmids also have T7 and Plac promoters that can be
utilized for gene expression.
or
http://aem.asm.org/content/72/7/5027.full
Ps: original hint was from
wurt
2012-02-04 03:30:25
来自: 202.
9f
>The streaking do not 'dilute' the plasmid, but simply purify the colonies.
The copy number of the plasmid mostly depend on your replication origin (
never use 2u origin if you want a low copy), and whether the plasmid contain
centromere (like CEN6 on pRS416). Usually the centromere sequence can limit
the copy number of your plasmid.
I don't think you need to wash or replica your plates. If you don't want to
have too many plasmids in one cell, just simply reduce the transformation
efficiency and
http://www.google.co.uk/#q=PRS416+promoter+未名+存档
please only google likes above,
i mean only limited to mitbbs Bio/medi Ban former post
then at least you can know knew key word which focuses on your target.
>
发信人: giantbird05 (大鸟), 信区: Biology
标 题: Re: 酵母互补试验好做吗？
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Oct 11 00:12:03 2013, 美东)
请问pRS416是什么启动子阿？
谢谢。
>>
>>>
【在 g*********5 的大作中提到】
: pRS416 mcs ?
: under the T7 ?
: would you please give me a link?
: I googled and more confused.
: thanks.
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g*********5
发帖数: 2533 | 21 what different between Mat A and Mat Alpha?
one haploid one diploid?
【在 g*********5 的大作中提到】
: 谢谢大家。看到thermo 有现成的敲除的strain卖，就是基因型看得头昏。
: Strain Background Genotype
: Mat A BY4730 MATa leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
: Mat Alpha BY4739 MATalpha leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
: Mat A BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
: Mat Alpha BY4742 MATalpha his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
: Het/Hom Dip BY4743 4741/4742
: 我要的菌株是Yeast HetDip Knock Out Strain YJR045C
: 怎么样的平板才能使敲除的菌株不长啊？能买到板吗？
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X******n
发帖数: 914 | 22 一个公的一个母的
【在 g*********5 的大作中提到】
: what different between Mat A and Mat Alpha?
: one haploid one diploid?
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