s******y
发帖数: 28562 | 1 有没有人做过相关的比较？哪个病毒载体在感染细胞之后表达得比较快，哪个比较慢？
我的印象中好像是Lentivirus最慢，但是我没有看过相关文献不知道是不是对的。
谢谢！ |
z********8
发帖数: 818 | 2
a good question. 但是我更想知道如果选择应用这些virus，他们的区别是什么。
【在 s******y 的大作中提到】
: 有没有人做过相关的比较？哪个病毒载体在感染细胞之后表达得比较快，哪个比较慢？
: 我的印象中好像是Lentivirus最慢，但是我没有看过相关文献不知道是不是对的。
: 谢谢！
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S*********s
发帖数: 304 | 3 用过lenti/retro
感觉表达差不多，基本要2-3天。
lenti titer比较高 > retro.
两者包装的片段大小都有限，<80KD, 再大一点的蛋白对病毒滴度影响很大，一般需要
浓缩。
retro 较 lenti安全一些。包装retro的时候可以选择pCL-Eco, pCL-Ampho,etc等
不同的外壳蛋白。pCL-Eco只能介导感染mouse cell,在做oncongene的时候尤为重要。
你不希望用个EGFR mutant or K-Ras mutant的lentivirus 去感染你的小鼠or细胞，一
旦泄露，有oncogenesis的风险。
另外retro只感染分裂的细胞，生长很慢的细胞用retro感染效率很低。
另外从整合到基因组上的位点来看，lenti有 hotspot，retro更倾向于插入
transcription active的region。所以很多random mutagenesis是retro based的。
Adeno没用过，据说插入基因的size可以更大，但做载体比较麻烦,没经验。
【在 z********8 的大作中提到】
:
: a good question. 但是我更想知道如果选择应用这些virus，他们的区别是什么。
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c******r
发帖数: 3778 | 4 兄弟总结得真好，非常感谢！
还真没注意这个表达快慢的问题。Adeno的好处是titer可以非常高，比retro要高不少
。而且也比较安全，即使感染人也没什么大问题。
【在 S*********s 的大作中提到】
: 用过lenti/retro
: 感觉表达差不多，基本要2-3天。
: lenti titer比较高 > retro.
: 两者包装的片段大小都有限，<80KD, 再大一点的蛋白对病毒滴度影响很大，一般需要
: 浓缩。
: retro 较 lenti安全一些。包装retro的时候可以选择pCL-Eco, pCL-Ampho,etc等
: 不同的外壳蛋白。pCL-Eco只能介导感染mouse cell,在做oncongene的时候尤为重要。
: 你不希望用个EGFR mutant or K-Ras mutant的lentivirus 去感染你的小鼠or细胞，一
: 旦泄露，有oncogenesis的风险。
: 另外retro只感染分裂的细胞，生长很慢的细胞用retro感染效率很低。
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 Why not try combination of transposon and adenoviral and lentiviral vector
just 1-2 days,
Zhang W et al., (2013).
Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic
integration for stable transgene expression
in human cells.
PLoS One. 8: e76771.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24116154 |
s******y
发帖数: 28562 | 6 谢谢总结！
另外，这个快慢的问题对我们还是很重要的，因为有些细胞只能养三四天，如果用
lenti的话等表达出来的时候细胞已经不行了。
【在 S*********s 的大作中提到】
: 用过lenti/retro
: 感觉表达差不多，基本要2-3天。
: lenti titer比较高 > retro.
: 两者包装的片段大小都有限，<80KD, 再大一点的蛋白对病毒滴度影响很大，一般需要
: 浓缩。
: retro 较 lenti安全一些。包装retro的时候可以选择pCL-Eco, pCL-Ampho,etc等
: 不同的外壳蛋白。pCL-Eco只能介导感染mouse cell,在做oncongene的时候尤为重要。
: 你不希望用个EGFR mutant or K-Ras mutant的lentivirus 去感染你的小鼠or细胞，一
: 旦泄露，有oncogenesis的风险。
: 另外retro只感染分裂的细胞，生长很慢的细胞用retro感染效率很低。
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l**********1
发帖数: 5204 | 7 Fig 3 from LXX that Plos One paper,
vector
somatic
【在 l**********1 的大作中提到】
: Why not try combination of transposon and adenoviral and lentiviral vector
: just 1-2 days,
:
: Zhang W et al., (2013).
: Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic
: integration for stable transgene expression
: in human cells.
: PLoS One. 8: e76771.
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24116154
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c******r
发帖数: 3778 | 8 http://www.ohsu.edu/xd/about/services/integrity/upload/IBC_Pres
这儿有个比较图，挺有意思：
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢总结！
: 另外，这个快慢的问题对我们还是很重要的，因为有些细胞只能养三四天，如果用
: lenti的话等表达出来的时候细胞已经不行了。
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 that slide ppt file didn’t include after 2010 fall to now papers,
pls check,
200 times of ordinary retroviral vector that High-titre retroviral vector
system
Wu C, Lu Y.
High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human
and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages.
J Gen Virol. 2010 Aug;91: 1909-18.
Abstract
Genetically modified cells of haematopoietic and lymphocytic lineages could
provide potentially curative treatments for a wide range of inherited and
acquired diseases. However, this application is limited in mouse models by
the low efficiency of lentiviral vectors. To facilitate the rapid production
of high-titre helper-free retroviral vectors for enhanced gene delivery,
below ignored
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20410313
HTTP duble dot //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3052536/pdf/1909.pdf
more same group: Yuanan (Ron) Lu lab in University of Hawai
http://www.hawaii.edu/publichealth/faculty/profile/lu.html
relevant papers, pls go to,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lu+Yuanan%5BAuthor%5D+
【在 c******r 的大作中提到】
: http://www.ohsu.edu/xd/about/services/integrity/upload/IBC_Pres
: 这儿有个比较图，挺有意思：
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a****d
发帖数: 1919 | 10 个人经验， lentivirus （ubiqutin promoter） 感染的细胞，12小时后可以看到eGFP
表达。 CAG-CMV promoter based lenti也能很快看到外源基因表达。
我培养的原代细胞，D0用lenti处理，D3 固定染色，没有问题。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢总结！
: 另外，这个快慢的问题对我们还是很重要的，因为有些细胞只能养三四天，如果用
: lenti的话等表达出来的时候细胞已经不行了。
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z********8
发帖数: 818 | 11
如果只是immuofluorensence， adenovirus overnight就可以了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢总结！
: 另外，这个快慢的问题对我们还是很重要的，因为有些细胞只能养三四天，如果用
: lenti的话等表达出来的时候细胞已经不行了。
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z********8
发帖数: 818 | |
g*********3
发帖数: 177 | 13 这个还真没有关注过，一般在70%左右transfect细胞，然后48hr后收细胞，这时候细胞
已经非常confluent了。不知道有没可能蛋白被细胞讲解。 |
j******i
发帖数: 939 | 14 快慢很重要的话 那直接转蛋白好了 我在做用lenti直接装蛋白的技术 半个小时就能进
到细胞里边 half-life的话看蛋白本身 |
c******r
发帖数: 3778 | 15 这个能介绍下不？
【在 j******i 的大作中提到】
: 快慢很重要的话 那直接转蛋白好了 我在做用lenti直接装蛋白的技术 半个小时就能进
: 到细胞里边 half-life的话看蛋白本身
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s******y
发帖数: 28562 | 16 能不能给个文献？这个技术好用么？是不是什么蛋白都能装进去？
【在 j******i 的大作中提到】
: 快慢很重要的话 那直接转蛋白好了 我在做用lenti直接装蛋白的技术 半个小时就能进
: 到细胞里边 half-life的话看蛋白本身
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j******i
发帖数: 939 | 17 我们的文章投在Nucleic Acids Research 还没有见刊
我不知道能不能在这里贴摘要 还是把摘要发给你吧 我们装过一些gene editing的酶
有成功的也有失败的 我们的经验是只要蛋白不超过100kd 包装效率还是很高的
【在 s******y 的大作中提到】
: 能不能给个文献？这个技术好用么？是不是什么蛋白都能装进去？
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 protein transfection of mouse lung
PMID 23711820
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23711820/ |
s******y
发帖数: 28562 | 19 谢谢！看到了你发的信了。你们的文章很有趣，应该有一定用处（而且应该可以卖专利
费）。可惜还是不能随便什么蛋白都装。
【在 j******i 的大作中提到】
: 我们的文章投在Nucleic Acids Research 还没有见刊
: 我不知道能不能在这里贴摘要 还是把摘要发给你吧 我们装过一些gene editing的酶
: 有成功的也有失败的 我们的经验是只要蛋白不超过100kd 包装效率还是很高的
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w********r
发帖数: 1431 | 20 adeno很快，infect之后24小时之内就可以看见GFP表达了。
【在 S*********s 的大作中提到】
: 用过lenti/retro
: 感觉表达差不多，基本要2-3天。
: lenti titer比较高 > retro.
: 两者包装的片段大小都有限，<80KD, 再大一点的蛋白对病毒滴度影响很大，一般需要
: 浓缩。
: retro 较 lenti安全一些。包装retro的时候可以选择pCL-Eco, pCL-Ampho,etc等
: 不同的外壳蛋白。pCL-Eco只能介导感染mouse cell,在做oncongene的时候尤为重要。
: 你不希望用个EGFR mutant or K-Ras mutant的lentivirus 去感染你的小鼠or细胞，一
: 旦泄露，有oncogenesis的风险。
: 另外retro只感染分裂的细胞，生长很慢的细胞用retro感染效率很低。
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K**R
发帖数: 193 | 21 我觉得adeno 快些吧，lenti 咋说还的整合到chromosome里。 另外应该是lenti，比
如retro安全吧，可能titration低一点？ lenti是retro 替换性产品，应为我当时当
销售买过的。 |
s******y
发帖数: 28562 | 22 谢谢！Lenti比retro 安全一点点而已（致癌性不强）。替代的主要原因应该是因为
Lenti可以感染不分裂的细胞吧？
【在 K**R 的大作中提到】
: 我觉得adeno 快些吧，lenti 咋说还的整合到chromosome里。 另外应该是lenti，比
: 如retro安全吧，可能titration低一点？ lenti是retro 替换性产品，应为我当时当
: 销售买过的。
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D*******D
发帖数: 100 | 23 我的经验adeno是第二天就能看到不错的GFP了，lenti也不是很慢但是GFP上升趋势缓慢
。 |
j******i
发帖数: 939 | 24 基因治疗上lenti取代retro是个趋势 最主要的是安全性 因为retro偏向查到
regulatory region 因此激活癌基因的可能性大 所有的retro引起白血病的例子就是这
个原因 而lenti喜欢查到基因里边 因而激活癌基因的风险小 当然随之而来的是打乱基
因正常的splicing 目前基因治疗还没有lenti引起白血病的例子 |
a*******a
发帖数: 4233 | 25 lenti 24小时后能看到gfp
问题是一定要在细胞贴壁以后再感染，不然可能会造成细胞融合。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢总结！
: 另外，这个快慢的问题对我们还是很重要的，因为有些细胞只能养三四天，如果用
: lenti的话等表达出来的时候细胞已经不行了。
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t********n
发帖数: 64 | 26 gene therapy主要不是Adeno?
【在 j******i 的大作中提到】
: 基因治疗上lenti取代retro是个趋势 最主要的是安全性 因为retro偏向查到
: regulatory region 因此激活癌基因的可能性大 所有的retro引起白血病的例子就是这
: 个原因 而lenti喜欢查到基因里边 因而激活癌基因的风险小 当然随之而来的是打乱基
: 因正常的splicing 目前基因治疗还没有lenti引起白血病的例子
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j******i
发帖数: 939 | 27 是adeno adeno是non-integrating virus 所以不能用到t细胞，hsc，iPSCs这些会分裂
的细胞上
【在 t********n 的大作中提到】
: gene therapy主要不是Adeno?
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i****r
发帖数: 14 | 28 lenti(retro)确实比Adono 慢，名字都叫慢病毒了。 |
G*****m
发帖数: 198 | 29 it also depends on promoter |
p******b
发帖数: 379 | 30 我个人的经验是， 不同的细胞表达GFP的快慢也不一样， 同样的病毒同时感染两种不
同的细胞， 有的细胞出GFP的时候快， 有的细胞慢， 比如MM231 GFP在感染十几个小
时之后就非常明显了， 然而有些细胞48小时才明显
同样的病毒用相同的滴度感染不同的细胞， 感染效率也不一样。
可能跟细胞的病毒受体多少有关， 病毒进入不同细胞的快慢和多少不一样
当然同样是lenti， 不同promoter， 感染的快慢和效率也不一样
感染的方法可能也有点影响， 江湖传说reverse infection（感染当天trypsin细胞，
同时把细胞，病毒和HB一起加到培养皿）比普通的先铺好细胞第二天感染效率高一点点
， |
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g****0
发帖数: 425 | 31 Can I get the abstract as well?
How do you comment on this report?
Nucleic Acids Res. 2013 Mar 1;41(5):e63. doi: 10.1093/nar/gks1446. Epub 2012
Dec 28.
Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and
lentiviral vector gene transfer into human cells.
Holkers M, Maggio I, Liu J, Janssen JM, Miselli F, Mussolino C, Recchia A,
Cathomen T, Gonçalves MA.
Source
Department of Molecular Cell Biology, Leiden University Medical Center,
Eithovenweg 20, 2333 ZC Leiden, The Netherlands.
Abstract
The array of genome editing strategies based on targeted double-stranded DNA
break formation have recently been enriched through the introduction of
transcription activator-like type III effector (TALE) nucleases (TALENs). To
advance the testing of TALE-based approaches, it will be crucial to deliver
these custom-designed proteins not only into transformed cell types but
also into more relevant, chromosomally stable, primary cells. Viral vectors
are among the most effective gene transfer vehicles. Here, we investigated
the capacity of human immunodeficiency virus type 1- and adenovirus-based
vectors to package and deliver functional TALEN genes into various human
cell types. To this end, we attempted to assemble particles of these two
vector classes, each encoding a monomer of a TALEN pair targeted to a
bipartite sequence within the AAVS1 'safe harbor' locus. Vector DNA analyses
revealed that adenoviral vectors transferred intact TALEN genes, whereas
lentiviral vectors failed to do so, as shown by their heterogeneously sized
proviruses in target cells. Importantly, adenoviral vector-mediated TALEN
gene delivery resulted in site-specific double-stranded DNA break formation
at the intended AAVS1 target site at similarly high levels in both
transformed and non-transformed cells. In conclusion, we demonstrate that
adenoviral, but not lentiviral, vectors constitute a valuable TALEN gene
delivery platform.
【在 j******i 的大作中提到】
: 我们的文章投在Nucleic Acids Research 还没有见刊
: 我不知道能不能在这里贴摘要 还是把摘要发给你吧 我们装过一些gene editing的酶
: 有成功的也有失败的 我们的经验是只要蛋白不超过100kd 包装效率还是很高的
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