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Biology版 - 谈谈和蛋白打交道的日子 (五)Tag! You’re it.
相关主题
怎么保持蛋白结构?Western蛋白分子量变大很多是什么情况?
新手求教两个蛋白的作用位点Re: 请问一个关于保存酶的问题
peptide in solution怎么handle求救?急问, 纯化出来的蛋白怎么保存?
如何用实验确定小分子配体在蛋白受体上的结合残基?在跑SDS胶做Mass Spec之前如何有效出去elution sample中的3XFLAG肽
求教高pH条件蛋白电泳请教buffer里的各种成分作用
一个未知蛋白的的纯化疑问EMSA疑问
请教IP怎么控制input的量请问谁从肿瘤中用western blot 测定过某蛋白的量?
in western for a 25kd protein, the band is at 50kd怎么研究能进细胞核的蛋白质
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话题: 蛋白话题: tag话题: nickel话题: his话题: 纯化
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c********n
发帖数: 225
1
第五篇 Tag! You’re it.
这篇回顾一下用His-tag纯化蛋白带来的一些花絮。
每个蛋白都有自己的脾气,所以表达和纯化他们其实就有点像cooking,从原材料的准
备,配方到调味,把握火候,最后色香味俱全才可能成为一道佳肴 – 对于蛋白就是要
达到有其对应的生物活性了。每每看到“保证型”蛋白表达服务的宣传,心里笑一下,
然后就会想到自己的一个“秘密武器” – 有一个融合蛋白确实可以达到几乎100%的高
效表达, 只是都在包涵体里。从另一方面来讲,如果没有时间和经费的限制,确实每
一个蛋白只要花功夫去做,最后都能达到100%成功率,得到有生物活性的终产物。
大部分人的时间和经费都有限,也不是每一个人都有耐心或有必要成为大厨, 那么就
有了purification tag。 His-tag是个经典。说起Histidine这个氨基酸,它的
imidazole side chain的pKa在6左右,这个特性让Histidine成为很多酶的活性中心的
一个重要组分, 这方面这次就不多讲了;另一方面,histidine也是个很好的metal
chelator, 是很多metalloprotein的一个必须, 这个特性也造就了 His-tag这个方便
的蛋白纯化工具。
大多数His-tag纯化树脂都用到Nickel。这个metal ion一方面chelate在树脂上,另一
方面结合His-tag。其实树脂和His-tag之间相对于Nickel是动态竞争关系,如果想更好
的结合His-tag protein, Nickel的 chelating site就要对蛋白exposed的多一些,那
么Nickel随着蛋白一起脱离树脂的几率也就增大,因而不可避免就会有Nickel
contaminated His-tag protein的现象。下面就描述一下两个extreme的例子。
第一个例子是个function unknown的hypothetical DNA binding protein。
这是个pI很高,十几个kDa的蛋白,在pH 7是highly positively charged, 适合于
binding negatively charged DNA。用His-tag在E. coli 里面表达量很高,NMR 15N
HSQC检测证明是fully folded, 可是非常奇怪的是,有将近三分之一的HSQC peak是看
不到的;而用其他方法(质谱和蛋白胶)检测到的都是全长蛋白,那么HSQC peak藏到
哪里去了?
含有paramagnetic metal的蛋白会导致一些NMR峰从正常区域里消失,而His-tag
chelates Nickel,这是否会是症结?于是送样品去做ICP-MS检测metal的含量,确实非
常明显的含有Nickel。症结找到了,随后做实验去除Nickel。简单的在样品里加入EDTA
无法让隐藏的peaks现身,只有用高浓度EDTA做overnight dialysis处理后, 整个蛋白
的图谱才完整出现。还好,这个蛋白不是metalloprotein,不然这么大量的EDTA会让它
失活的。
不是每一个His-tag提纯的蛋白都会有这个现象的。即使有Nickel contamination,也
不会像这个蛋白一样,由于His-tag本身的charge以及可能mimic DNA的缘故, 使得His
-tag -Nickel和蛋白结合的很紧密。
第二个例子是个IgG binding protein
这个蛋白pI很低,在pH 7是negatively charged。同样,用His-tag在E. coli 里面表
达量很高,纯化后检测的活性也很高。从1L里提取的蛋白颜色有点微黄, 没有在意,
就scale up到10L提取。蛋白浓度很高,可是有着light beer的黄褐色, 加入储藏必须
用的DTT以后更是变为dark beer的深褐色!而蛋白本身不含可能使其有颜色的metal或
者其他co-factor, 那么这个颜色是什么?
有一个2000年的patent是快速colorimetric方法在蛋白溶液里检测Nickel和cobalt,就
是用的DTT和phosphate buffer。那么这个深褐色不会又是Nickel吧?是的,同样ICP-
MS可以在样品里检测到大量的Nickel,同样去除Nickel又不是件容易的事。幸好这个蛋
白是热稳定的, 加入大量的EDTA高温处理,再dialysis,蛋白就会成为本来应有的无
色透明状态, 并保持高活性。
这第二个例子让我常常想,那么其他negatively charged蛋白,用Nickel column 大量
纯化后,会不会也有这种啤酒的颜色呢?
以上两个例子都很extreme。只有extreme的经历以后才会感触很深。如果你的Nickel
resin纯化出的His-tag蛋白有点异常, 不妨用ICP-MS去检测一下metal的含量。
就像经典的Tag游戏,被tag了,遇到问题了,就按游戏规则找解决方案吧。
-CoinByCoin
May 4th,2014
a****d
发帖数: 1919
2
Post of the year!
w*****1
发帖数: 414
3
mark thanks!
b******y
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4
Very nice.
s*****g
发帖数: 7857
5
先顶,再看!

【在 c********n 的大作中提到】
: 第五篇 Tag! You’re it.
: 这篇回顾一下用His-tag纯化蛋白带来的一些花絮。
: 每个蛋白都有自己的脾气,所以表达和纯化他们其实就有点像cooking,从原材料的准
: 备,配方到调味,把握火候,最后色香味俱全才可能成为一道佳肴 – 对于蛋白就是要
: 达到有其对应的生物活性了。每每看到“保证型”蛋白表达服务的宣传,心里笑一下,
: 然后就会想到自己的一个“秘密武器” – 有一个融合蛋白确实可以达到几乎100%的高
: 效表达, 只是都在包涵体里。从另一方面来讲,如果没有时间和经费的限制,确实每
: 一个蛋白只要花功夫去做,最后都能达到100%成功率,得到有生物活性的终产物。
: 大部分人的时间和经费都有限,也不是每一个人都有耐心或有必要成为大厨, 那么就
: 有了purification tag。 His-tag是个经典。说起Histidine这个氨基酸,它的

W***o
发帖数: 6519
6
干一行喜欢一行最重要,别管钱多钱少,喜欢,有定力就好!
ps:楼主说的这些我当年也作过很多,提蛋白有几次需要养20L的细菌摇过夜,蛋白提
纯以后没有活性,还得用tev把his tag切掉,再过sizing column, 总之非常的
frustrating,不是很enjoy那样的生活

【在 c********n 的大作中提到】
: 第五篇 Tag! You’re it.
: 这篇回顾一下用His-tag纯化蛋白带来的一些花絮。
: 每个蛋白都有自己的脾气,所以表达和纯化他们其实就有点像cooking,从原材料的准
: 备,配方到调味,把握火候,最后色香味俱全才可能成为一道佳肴 – 对于蛋白就是要
: 达到有其对应的生物活性了。每每看到“保证型”蛋白表达服务的宣传,心里笑一下,
: 然后就会想到自己的一个“秘密武器” – 有一个融合蛋白确实可以达到几乎100%的高
: 效表达, 只是都在包涵体里。从另一方面来讲,如果没有时间和经费的限制,确实每
: 一个蛋白只要花功夫去做,最后都能达到100%成功率,得到有生物活性的终产物。
: 大部分人的时间和经费都有限,也不是每一个人都有耐心或有必要成为大厨, 那么就
: 有了purification tag。 His-tag是个经典。说起Histidine这个氨基酸,它的

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