f*****n
发帖数: 499 | 1 最近做一个DNA damage的实验，就是用H2O2来诱导Hek细胞基因组oxidative damage；
然后用FPG这种能识别8-oxoG的酶来切，被切的基因组位点会产生nick，阻碍PCR
polymerase，基于这样的原理做qPCR定量来研究某段序列对于oxidative damage的反
应。
好像这种做法比较少见，大部分DNA damage的研究都是global的。但也有很好的先例比
如：
http://www.nature.com/nature/journal/v429/n6994/abs/nature02661.html
这篇经典的Nature 文章
我按照这篇文章的做法，把genomic DNA进行FPG overnight digestion （DNA+FPG+Neb
buffer+BSA），同时也做了mock control（DNA+水+Neb buffer+BSA），然后qPCR发现
Ct如下：
DNA：25
DNA+FPG+buffer：28
DNA+水+buffer： 28
让我惊讶的是，相比于纯DNA，mock control的DNA+水+buffer然后overnight
incubation会导致这么低的Ct，请问是导致DNA降解了呢？还是说（neb buffer+BSA）
过夜incubation会影响qPCR呢？
所以有两个问题：
第一，这个FPG到底应该37度incubate多久呢？我看很多comet assay都是直接37度孵育
1-2小时就够了，但类似上面的那个Nature文章都建议overnight
第二，关于DNA damage的实验，这些lesion比如8-oxoG或者nick，gap有多稳定呢？比
如我DNA extraction完成后，我的genomic DNA应该如何保存？保存到4度我担心会被氧
化，保存到-20我又害怕反复freeze-thaw会引起人为的DNA损伤
小弟我完全不是做DNA damage领域的，只是实验需要，请各位DNA damage专家帮帮忙。
非常感谢！ |
l**k
发帖数: 22 | 2 DNA提取后氧化是非常普遍和难以避免的问题，有文章说当DNA总量大于30微克后才能防
止氧化，当然你可以用未处理的细胞作为对照。至于加水incubate后qpcr下降，你可能
要检查一下你的试剂，有人说neb的BSA过夜时确实会降解DNA，乙酰化BSA会更好一些。 |
f*****n
发帖数: 499 | 3 谢谢。
今天重新做了1-2小时的fpg incubation，最后得到了很好的预期的结果，就是（fpg -
mock）和 （fpg+ 样本）在qPCR后Ct有明显的3-4 cycle的差别。
然后把这些genomic DNA都跑了1%的gel ,如图。lane1（mock）和lane2（+fpg）是切一
小时的结果；lane3和lane4明显什么都没有，lane5是positive ctrl。
还是很惊讶nebuffer+BSA incubate genomic DNA overnight会导致DNA degradation；
另外如图里lane1和lane5都是标准的gDNA gel pattern就是有个23kb的sharp bands，
而lane2中因为fpg treat所以high-molecular-weight band都被切没了。不知道这解释
对不对
【在 l**k 的大作中提到】
: DNA提取后氧化是非常普遍和难以避免的问题，有文章说当DNA总量大于30微克后才能防
: 止氧化，当然你可以用未处理的细胞作为对照。至于加水incubate后qpcr下降，你可能
: 要检查一下你的试剂，有人说neb的BSA过夜时确实会降解DNA，乙酰化BSA会更好一些。
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