f*****n 发帖数: 499 | 1 最近做一个DNA damage的实验,就是用H2O2来诱导Hek细胞基因组oxidative damage;
然后用FPG这种能识别8-oxoG的酶来切,被切的基因组位点会产生nick,阻碍PCR
polymerase,基于这样的原理做qPCR定量来研究某段序列对于oxidative damage的反
应。
好像这种做法比较少见,大部分DNA damage的研究都是global的。但也有很好的先例比
如:
http://www.nature.com/nature/journal/v429/n6994/abs/nature02661.html
这篇经典的Nature 文章
我按照这篇文章的做法,把genomic DNA进行FPG overnight digestion (DNA+FPG+Neb
buffer+BSA),同时也做了mock control(DNA+水+Neb buffer+BSA),然后qPCR发现
Ct如下:
DNA:25
DNA+FPG+buffer:28
DNA+水+buffer: 28
让我惊讶的是,相比于纯DNA,mock control的DNA+水+buffer然后overnight
incubation会导致这么低的Ct,请问是导致DNA降解了呢?还是说(neb buffer+BSA)
过夜incubation会影响qPCR呢?
所以有两个问题:
第一,这个FPG到底应该37度incubate多久呢?我看很多comet assay都是直接37度孵育
1-2小时就够了,但类似上面的那个Nature文章都建议overnight
第二,关于DNA damage的实验,这些lesion比如8-oxoG或者nick,gap有多稳定呢?比
如我DNA extraction完成后,我的genomic DNA应该如何保存?保存到4度我担心会被氧
化,保存到-20我又害怕反复freeze-thaw会引起人为的DNA损伤
小弟我完全不是做DNA damage领域的,只是实验需要,请各位DNA damage专家帮帮忙。
非常感谢! |
l**k 发帖数: 22 | 2 DNA提取后氧化是非常普遍和难以避免的问题,有文章说当DNA总量大于30微克后才能防
止氧化,当然你可以用未处理的细胞作为对照。至于加水incubate后qpcr下降,你可能
要检查一下你的试剂,有人说neb的BSA过夜时确实会降解DNA,乙酰化BSA会更好一些。 |
f*****n 发帖数: 499 | 3 谢谢。
今天重新做了1-2小时的fpg incubation,最后得到了很好的预期的结果,就是(fpg -
mock)和 (fpg+ 样本)在qPCR后Ct有明显的3-4 cycle的差别。
然后把这些genomic DNA都跑了1%的gel ,如图。lane1(mock)和lane2(+fpg)是切一
小时的结果;lane3和lane4明显什么都没有,lane5是positive ctrl。
还是很惊讶nebuffer+BSA incubate genomic DNA overnight会导致DNA degradation;
另外如图里lane1和lane5都是标准的gDNA gel pattern就是有个23kb的sharp bands,
而lane2中因为fpg treat所以high-molecular-weight band都被切没了。不知道这解释
对不对
【在 l**k 的大作中提到】 : DNA提取后氧化是非常普遍和难以避免的问题,有文章说当DNA总量大于30微克后才能防 : 止氧化,当然你可以用未处理的细胞作为对照。至于加水incubate后qpcr下降,你可能 : 要检查一下你的试剂,有人说neb的BSA过夜时确实会降解DNA,乙酰化BSA会更好一些。
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