c********6
发帖数: 693 | 1 Sci Rep. 2016 Dec 2;6:38198. doi: 10.1038/srep38198.
Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in
patient-derived iPSC by Cas9 nickase.
Eggenschwiler R1,2, Moslem M1,2, Fráguas MS1,2, Galla M3, Papp O1,2,
Naujock M4, Fonfara I5,6, Gensch I1,2, Wähner A1,2, Beh-Pajooh A1,2,
Mussolino C7,8,9, Tauscher M10, Steinemann D11, Wegner F4, Petri S4,
Schambach A3, Charpentier E5,6, Cathomen T7,8,9, Cantz T1,2,11.
In order to help enforcing bi-allelic targeting with the new donor construct
, we reasoned that a dual-fluorescence approach using a combination of both,
eGFP- and DsRedEx-containing donors, might present a valid strategy.
Presence of two fluorescence markers within the same clone should indicate
that the corresponding cell line has integrated one fluorescence marker on
each allele. To this end, hPi cells were transfected with both donors and
Cas9_D10A nickase and AAT_g1 and AAT_g2 sgRNAs and selected using puromycin
followed by FACS sorting for the eGFP+, DsRed+ double positive fraction (Fig
. 3D). | c********6
发帖数: 693 | 2
construct
both,
【在 c********6 的大作中提到】
: Sci Rep. 2016 Dec 2;6:38198. doi: 10.1038/srep38198.
: Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in
: patient-derived iPSC by Cas9 nickase.
: Eggenschwiler R1,2, Moslem M1,2, Fráguas MS1,2, Galla M3, Papp O1,2,
: Naujock M4, Fonfara I5,6, Gensch I1,2, Wähner A1,2, Beh-Pajooh A1,2,
: Mussolino C7,8,9, Tauscher M10, Steinemann D11, Wegner F4, Petri S4,
: Schambach A3, Charpentier E5,6, Cathomen T7,8,9, Cantz T1,2,11.
: In order to help enforcing bi-allelic targeting with the new donor construct
: , we reasoned that a dual-fluorescence approach using a combination of both,
: eGFP- and DsRedEx-containing donors, might present a valid strategy.
| c********6
发帖数: 693 | | c********6
发帖数: 693 | | m*********D
发帖数: 1727 | 5 对BP系统不熟悉。你上次说可以不留下任何痕迹，那肯定比Cre/LoxP好。LoxP我记得蛮
长的，就是在initron里，也担心影响splicing。
个人觉得没必要两个颜色的selection maker。这样导致在两个homologous arms之间的
insertion太大。看了他用PCR来确认正确克隆，实际上是两个HDR arm上一边一个PCR来
确认的。不知道是不是担心PCR有不确定性，还用了southern来证明integration site
。这个太麻烦。从他用一个颜色的selection marker（Fig2)来看，拿到double-
replacement的效率不错，40%。说明一个颜色就可以了。或者，我就干脆用一个G418。
我记得一个G418的表达cassette只有1。2Kb,在这个cassette两边加PB,PB外面是HDR的
arms,一边1kb。这样，要确认正确克隆的时候，用一对在HDR template外面的PCR
primers,就可以解决了。这个PCR产物是1+1。2+1=3。2kb，NEB的Q5 polymerase应该可
以了。 | c********6
发帖数: 693 | 6 他这篇文章出来了，如果只是再在homologous arm的外面，
再加了一个第三种荧光来作为random integration的negative selection，能够被
Nature系统的杂志接
收吗？
site
【在 m*********D 的大作中提到】
: 对BP系统不熟悉。你上次说可以不留下任何痕迹，那肯定比Cre/LoxP好。LoxP我记得蛮
: 长的，就是在initron里，也担心影响splicing。
: 个人觉得没必要两个颜色的selection maker。这样导致在两个homologous arms之间的
: insertion太大。看了他用PCR来确认正确克隆，实际上是两个HDR arm上一边一个PCR来
: 确认的。不知道是不是担心PCR有不确定性，还用了southern来证明integration site
: 。这个太麻烦。从他用一个颜色的selection marker（Fig2)来看，拿到double-
: replacement的效率不错，40%。说明一个颜色就可以了。或者，我就干脆用一个G418。
: 我记得一个G418的表达cassette只有1。2Kb,在这个cassette两边加PB,PB外面是HDR的
: arms,一边1kb。这样，要确认正确克隆的时候，用一对在HDR template外面的PCR
: primers,就可以解决了。这个PCR产物是1+1。2+1=3。2kb，NEB的Q5 polymerase应该可
| m*********D
发帖数: 1727 | 7 推进了一步，有可能的，值得试试。好运！
【在 c********6 的大作中提到】
: 他这篇文章出来了，如果只是再在homologous arm的外面，
: 再加了一个第三种荧光来作为random integration的negative selection，能够被
: Nature系统的杂志接
: 收吗？
:
: site
| j*********g
发帖数: 463 | 8 他都只能发Sci Rep，你再加点东西为啥就能上NBT？
[在 crispr2016 () 的大作中提到：]
:他这篇文章出来了，如果我跟他的思路一模一样，我只是再在homologous arm的外面
，再加了一个蓝色荧光来作为random integration的negative selection，能够被NBT
接收吗？
:site | c********6
发帖数: 693 | 9 我还能申请专利吗
NBT
【在 j*********g 的大作中提到】
: 他都只能发Sci Rep，你再加点东西为啥就能上NBT？
: [在 crispr2016 () 的大作中提到：]
: :他这篇文章出来了，如果我跟他的思路一模一样，我只是再在homologous arm的外面
: ，再加了一个蓝色荧光来作为random integration的negative selection，能够被NBT
: 接收吗？
: :site
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