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m******h
发帖数: 38
1
做一个Co-IP实验,检测骨架蛋白plectin(>500KD)与一个GTPase(A)的相互作用。内
源plectin,高表达A(A-flag)或 dominant negative A (DN-A-flag)。用plectin单抗做
IP,anti-flag blot 显示A-flag可以被co-IP下来,同样的co-IP GFP-negative
control 背景比较干净,而co-IP DN-A-flag有微弱信号(约为A-flag 的1/10)。
用做IP同样的antibody blot plectin,input 部分一切正常,显示相同的内源plectin;
问题出在 straight IP部分,同样的抗体同时blot同一块胶上的IP部分,没有任何信号
show out。这一结果已至少重复3次(重复性很好)。
考虑到plectin分子量巨大,试过不同的gel concentration 和transfer time。但始终
不能解决这一问题。
其它可能情况:
1. plectin与A相互作用后translocation 到膜结构中,导致常规lysis buffer不能裂解
,所以IP part没有信号?
2. 形成复杂结构且resistant to SDS? 很难make sense.
3.......
不知描述是否清楚。请问诸位是否遇到过类似问题?没有的话大家讨论一下what
happened? 谢谢
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