w*********n
发帖数: 439 | 1 各位大侠,
请问版上有谁在按照Rich Young的CHIPprotol在作的？我发现拿Young的Wash Buffer
RIPA 洗不干净beads，有人有同样感觉吗？ |
k*****n
发帖数: 323 | 2 我做的protocol在incubation和洗的solution和rick的是一样的，你用的是什么bead？ |
w*********n
发帖数: 439 | 3 现在在用Dyanl Protein A,和 Millipore Proeian A magnitic Beads.
你能洗干净吗？我是说negative 的PCR没有band，而positive 的PCR有band？
【在 k*****n 的大作中提到】
: 我做的protocol在incubation和洗的solution和rick的是一样的，你用的是什么bead？
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d****7
发帖数: 109 | 4 这个protocol我从三年前开始PhD时候就用，到现在都没问题，你确定你的buffer没问
题？
上结果来看看
【在 w*********n 的大作中提到】
: 各位大侠,
: 请问版上有谁在按照Rich Young的CHIPprotol在作的？我发现拿Young的Wash Buffer
: RIPA 洗不干净beads，有人有同样感觉吗？
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d****7
发帖数: 109 | 5 嗯，我也用Dyna Protein A，
你是指negative PCR和postive的band一样强？用real time看一眼
【在 w*********n 的大作中提到】
: 现在在用Dyanl Protein A,和 Millipore Proeian A magnitic Beads.
: 你能洗干净吗？我是说negative 的PCR没有band，而positive 的PCR有band？
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w*********n
发帖数: 439 | 6 多谢指教~
我看到别的protocol比如Upstate的protocol是用low salt, High salt, Licl, TE
这4个buffer 各洗2遍， 但是Rich Young 的protocol是用RIPA/Licl这一种buffer洗4-
7遍
我有点怀疑。
【在 d****7 的大作中提到】
: 这个protocol我从三年前开始PhD时候就用，到现在都没问题，你确定你的buffer没问
: 题？
: 上结果来看看
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w*********n
发帖数: 439 | 7 多谢指教~
我看到别的protocol比如Upstate的protocol是用low salt, High salt, Licl, TE
这4个buffer 各洗2遍， 但是Rich Young 的protocol是用RIPA/Licl这一种buffer洗4-
7遍
我有点怀疑。我再试一下Rich Young的protocl
【在 d****7 的大作中提到】
: 这个protocol我从三年前开始PhD时候就用，到现在都没问题，你确定你的buffer没问
: 题？
: 上结果来看看
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k*****n
发帖数: 323 | |
w*********n
发帖数: 439 | 9 30个cycle
【在 k*****n 的大作中提到】
: 你pcr cycle多少。。。。。
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k*****n
发帖数: 323 | 10 你的negative control是指chip样品的还是input？ |
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w*********n
发帖数: 439 | 11 Chip拉下来的sample，
就是不该有TF结合的地方，却能做出PCR band.
你一般拿RIPA buffer洗几遍能洗干净？
如果你的没问题那就可能是我自己的问题，我重配Rich Young的RIPA buffer再试一下
，多谢指教~
【在 k*****n 的大作中提到】
: 你的negative control是指chip样品的还是input？
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k*****n
发帖数: 323 | 12 4－5次ripa已经是非常严谨的洗法了，有时候如果抗体不是很好用的话，我都会减少到
3次。私信问你做chip－seq还是microarray也不说，问你negative control也不说。我
都做了几百个chip－seq了。帮你trouble shooting还不搭理人。whatever |
w*********n
发帖数: 439 | 13 不好意思阿。非常感谢你的热心帮助。我现在在做简单的chip-PCR，不久就会做chip-
seq.我这几天为chip的事情都要被老板压垮了，挨了不少骂，所以没回。，
非常抱歉。
【在 k*****n 的大作中提到】
: 4－5次ripa已经是非常严谨的洗法了，有时候如果抗体不是很好用的话，我都会减少到
: 3次。私信问你做chip－seq还是microarray也不说，问你negative control也不说。我
: 都做了几百个chip－seq了。帮你trouble shooting还不搭理人。whatever
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k*****n
发帖数: 323 | 14 我是用的real time pcr，取1／10的chip dna,大概cycle28，negative的signal都出来
了，所以可能是cycle太多了。但是你别的什么都不说，帮不了你 |
w*********n
发帖数: 439 | 15 如果我chip Elute DNA是100ul的话，你取10ul作realtimePCR？
你用RIPAbuffer wash的时候 是不是要加PMSF和Proteinas Inhibitor?
【在 k*****n 的大作中提到】
: 我是用的real time pcr，取1／10的chip dna,大概cycle28，negative的signal都出来
: 了，所以可能是cycle太多了。但是你别的什么都不说，帮不了你
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k*****n
发帖数: 323 | 16
是的，这里的10ul够做一个positive control 一个negative control的两个replica。
不加抑制剂。
还有，各种可能性
你的negative control 是什么？
chip的时候细胞多少，抗体多少，磁珠多少？
【在 w*********n 的大作中提到】
: 如果我chip Elute DNA是100ul的话，你取10ul作realtimePCR？
: 你用RIPAbuffer wash的时候 是不是要加PMSF和Proteinas Inhibitor?
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k*****n
发帖数: 323 | 17 我建议你最好从附近实验室找个做过chip的跟着学一趟。很多细节的操作每个人都不一
样。
good luck～
话说谢谢伪币，尽管我都不知道怎么用。。。。。 |
w*********n
发帖数: 439 | 18 给你发信了，麻烦你看一下
多谢~
【在 k*****n 的大作中提到】
: 我建议你最好从附近实验室找个做过chip的跟着学一趟。很多细节的操作每个人都不一
: 样。
: good luck～
: 话说谢谢伪币，尽管我都不知道怎么用。。。。。
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u**********d
发帖数: 573 | 19 崇拜！
【在 k*****n 的大作中提到】
: 4－5次ripa已经是非常严谨的洗法了，有时候如果抗体不是很好用的话，我都会减少到
: 3次。私信问你做chip－seq还是microarray也不说，问你negative control也不说。我
: 都做了几百个chip－seq了。帮你trouble shooting还不搭理人。whatever
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u**********d
发帖数: 573 | 20 如果是内源蛋白的话，阴性对照需要有两种，一个是用normal IgG，一个是没有转录因
子结合的区域也设计一对引物来扩增。有显著差异就可以了。如果是前一个对照不好，
可能是input里有大的凝聚物没有离心分离干净，也可能是beads没有封闭好，试着预清
除。把功课做好，让老板找不出茬，他再骂，炒了他！此处不留爷自由留爷处。
【在 w*********n 的大作中提到】
: 不好意思阿。非常感谢你的热心帮助。我现在在做简单的chip-PCR，不久就会做chip-
: seq.我这几天为chip的事情都要被老板压垮了，挨了不少骂，所以没回。，
: 非常抱歉。
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w*********n
发帖数: 439 | 21 ".....让老婆找不出茬...."非常admire你的回答，我今晚回家，老婆肯定要我跪搓板了
【在 u**********d 的大作中提到】
: 如果是内源蛋白的话，阴性对照需要有两种，一个是用normal IgG，一个是没有转录因
: 子结合的区域也设计一对引物来扩增。有显著差异就可以了。如果是前一个对照不好，
: 可能是input里有大的凝聚物没有离心分离干净，也可能是beads没有封闭好，试着预清
: 除。把功课做好，让老板找不出茬，他再骂，炒了他！此处不留爷自由留爷处。
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j****t
发帖数: 1663 | 22 你的观察应该是对的，光用RIPA/Licl洗背景会高一些吧，不如low salt, High salt,
Licl洗得干净，但洗得太干净了也会降低IP的效果。但是不管用什么buffer，都应该不
会太影响最后的结果（如果TF binding 很强的话）。
对于positive control region来说，用IgG来IP可能会得到一条很弱的band，用抗体IP
应该得到很强的band.不知道你选的negative region是否前面报道过，你也可以自己选
一些negative region来做PCR.如果你发现用抗体做ChIP，positive region和negative
region都能扩出带来，试试减少一下PCR cycle。但最好还是用real-time qPCR吧，因
为如果你的positive 和negative之间的差异非常小（小于one PCR cycle），就很难用
regular PCR的方法看出来。
最后一个可能性就是，你确定你用的试验条件能activate你的转录因子吗？最好做ChIP
之前confirm一下（用biochemistry的方法）。
总之，要考虑的因素很多，必需每个环节都仔细检查。To do that,每个环节都设个
positive 和negative control。Trouble shooting是个很烦人的事，多问问身边的同
事。世上无难事！
4-
【在 w*********n 的大作中提到】
: 多谢指教~
: 我看到别的protocol比如Upstate的protocol是用low salt, High salt, Licl, TE
: 这4个buffer 各洗2遍， 但是Rich Young 的protocol是用RIPA/Licl这一种buffer洗4-
: 7遍
: 我有点怀疑。我再试一下Rich Young的protocl
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n********k
发帖数: 2818 | 23 Well, While I applaud your spirits being critical which is very good and
essential in science, I also seem to see the tendency many have: when
something is not working, I did everything right...it must be something/
someone else that's wrong...In candor, with my own experience, with a newbie
, 9.9 out of 10 times, it is us who are being silly(or stupid)...More often
than not, we are either not experienced enough to take care of the details
or not diligent enough to delve into the very underlying principles/
knowledge...Just my two cents and good luck with your experiments...
【在 w*********n 的大作中提到】
: 各位大侠,
: 请问版上有谁在按照Rich Young的CHIPprotol在作的？我发现拿Young的Wash Buffer
: RIPA 洗不干净beads，有人有同样感觉吗？
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