M*******C
发帖数: 183 | 1 不知道在大家手上work的怎么样？买过好几种抗体。
在我手里，trouble很多啊，要么一堆杂带，没有特异带；要么背景很脏很黑，也看不
到特异带；要么带是白色的，并且结果也不是想要的。而类似的问题，我handle其他公
司的，失败率没这么高。测同一个蛋白，abcam的很好用，clean，结果正确。cell sig
的乱七八糟。trouble呢，公司都宣称在他们手里好用。
他们的western protocol是这样的，很不一般，大家觉得合理吗
Block： 5% Milk TBST （他们说不能用BSA)
一抗： 5% BSA TBST 稀释
二抗： 5% Milk TBST
平时我们要么是block/一抗都BSA. 要么是牛奶block， 一抗直接在TBST. 二抗从来只
是TBST. work的抗体总是work了。
而cell sig 的， 有的抗体，即使完全按照他们的说法，甚至他们寄来 positive ctrl
， 也不work， 而他们的positive ctrl， 我用 abcam的抗体轻易检测出。 abcam 的
问题是现在卖的太贵。而cell sig的花了钱不w... 阅读全帖 |
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M*******C
发帖数: 183 | 2 请问你用glycine PH 2.5之后，是水洗还是PBS/TBST之类的洗？
我看见网上一个类似的protocol，他们要PBS, TBST洗很久，这样strip耗时很长啊，不
知道有没有必要？ 以前我们NAOHstrip后，清水洗2min就好了。
http://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-
Mild stripping
Buffer, 1 L
15 g glycine
1 g SDS
10 mL Tween 20
Dissolve in 800 mL distilled water
Adjust pH to 2.2
Bring volume up to 1 L with distilled water
Procedure
Using a volume that will cover the membrane, incubate at room
temperature for 5–10 min.
Discard buffer
Repeat incub... 阅读全帖 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 3 洗的时间和TBST溶液的体积都有关。
多用TBST溶液，每次洗10分钟
显影时间长，背景就多。
10000 |
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s********n
发帖数: 248 | 4 M-CSF培养的bone marrow macrophage，stimulate以后western blot 磷酸化的AKT/ERK
/STAT1，其他两个都blot的很好，但是pAKT总是没有想要的带，貌似出来的带都是二抗
结合的非特异性带。
请问版上高人，有blot过pAKT的没有？能否帮我看看问题出在什么地方了啊？
我用的WASHING BUFFER是TBST with 0.05%Tween 20，
BLOCKING BUFFER:5%BSA/TBST,
一抗就dilute在blocking buffer里边。
protocol:
室温block 1h，一抗4度过夜，洗3次×10min；二抗室温30min，洗3次×15min。
我初步怀疑是tween 20量加多了，又看到班上有用pbs做washing buffer的，貌似pbs更
温和一些，不知道用pbs会不会好一些？
小女子多谢了先！ |
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b******n
发帖数: 4225 | 5 1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好
抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是... 阅读全帖 |
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i****g
发帖数: 3896 | 6 写得比较有意思，但是不太实用，可能实验条件相差太大。precast gel比自己制的gel
效果要好很多，结果也容易重复。antibody要看运气的，呵呵。
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这... 阅读全帖 |
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w********h
发帖数: 12367 | 7 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: bulletin (bulletin), 信区: Biology
标 题: 穷人的劳斯莱斯——五年western经验谈（转）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 2 23:29:05 2012, 美东)
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10... 阅读全帖 |
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r*****5
发帖数: 1876 | 8 谢谢你的建议，
我现在是用NP40 溶，然后冰上放10分钟，之后800G离心，分成两部分， 之后再用NP40
洗两遍核，然后用TBST-OG提取蛋白（我的是膜蛋白，很崩溃，一般的溶剂好像还不可
以），4度剧烈震荡30分钟，之后离心，
不过感觉不是很干净
但是我还觉得比公司的要好，哈哈
first |
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w******y
发帖数: 2504 | 9 The PVDF WB membrane was first probed with several different antibodies and
stripped between each probing, then it was stored in TBST. Yesterday, I
tried to probe for another target protein, seems like this old membrane dose
not work any more even if I probed with the antibody that worked on this
membrane. Any suggestions for this situation? Thanks. |
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s******r
发帖数: 2876 | 10 多谢你能抽空指点，
我block用的是5% milk in 1xTBST,
2抗之前步骤都相同，同一张膜剪两半。
2抗也是5% milk,1xTBST, 室温1hr，
TBST洗完了后，PBS洗两边，膜完全晾干后scan.
1), 2Ab是Licor自己的IRDye 800CW Goat anti-Mouse，#926-32210
1:5000 in 5% milk.
2), 双色彩图700 intensity 2.5, 800 intensity 5.
800单独扫描参数是 intensity 7.5.
sensitivity都用的缺省值5。
3), 上了四个图，ECL扫描的图，彩图包括700和800 channel，参数如上，
800单色图，参数如上，800灰度图，从800单色图export，没有压缩。
主要比较第一条lane。
因为只用了一种一抗，所以700灰度图应该没什么用。
麻烦帮着诊断诊断。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 11 用了4年licor了。感觉比ecl灵敏。
如果用pdvf （我一般只用nc），二抗中加点sds可以降低背景 。
actin不出来，原因应该是二抗问题。
还有，我从来不干膜，总是湿扫。
他家有专门的strip buffer，管用。
1:5，但是我用1：10，室温20分钟，4度两小时。
tbst洗4遍，可以直接用别的一抗。
有时候tubulin去不干净。 |
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s*****g
发帖数: 7857 | 12 那么2nd antibodies :anti-goat he anti-mouse 可以同时放吗?这样一来会不会相互
影响,以至背景很脏?
(block buffer, antibody buffer都是5% milk in TBST)
谢谢! |
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n******u
发帖数: 418 | 13 我用过这个v5 antibody
条件是 5% milk/TBST blocking，然后用goat anti-mouse或者goat anti-rabbit都没
问题，很干净 |
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b******r
发帖数: 111 | 14 Note: NHEs is membrane proteins that transmembrane 12 times. NHE5 is
localized to the plasma membrane;NHE6-9 reside on organellar membranes(
endosome,Golgi);
1. pcDNA transfects NHE5-9 through Fugene 6(ratio is 3 uL of Fugene/2 ug of
DNA) in 293 cells. After three days,collect cells.
2. Cold PBS washes cells. Add 150 uL of lysis buffer(final concentration:
50mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1% triton, 0.1% sds, cocktail inhibitor)
into each well of 6-well plate. Scrape cells.
3. The lysate gets st... 阅读全帖 |
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r***n
发帖数: 52 | 15 Thanks for your help. Actually, I'm not using isotope to label protein.It's
isotype for antibody control. Because all of papers published with IP
results showed IgG control, which is supposed to be no band of target. But
mine has the same band intensity as IP ones but wash off some after long
time incubation with TBST and detected by another species HRP.
- cellular tyrosine-
Immunoprecipitation positively
experiments |
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r***n
发帖数: 52 | 16 Thanks for your help. Actually, I'm not using isotope to label protein.It's
isotype for antibody control. Because all of papers published with IP
results showed IgG control, which is supposed to be no band of target. But
mine has the same band intensity as IP ones but wash off some after long
time incubation with TBST and detected by another species HRP.
- cellular tyrosine-
Immunoprecipitation positively
experiments |
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g*********5
发帖数: 2533 | 17 我的膜放了3个月在TBST COLD ROOM,
仍有信号，不过是licor系统的二抗。 |
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g********0
发帖数: 6201 | 18 抗体不怕反复冻融。
抗体的腐败反而是由于它的亲密战友-所谓工作液里起降背景的脱脂奶粉或BSA的快速腐败而
导致的。
我一向不认为脱脂奶粉或BSA能起多大的所谓降背景的作用。
我用抗体直接稀释在TBST或PBST里，含点triton就行了，我一抗里连叠氮钠都不加的。而如果有奶粉的话，加叠氮钠也没用，该臭就臭。
用完就冻起来，反复用几个月都没有问题。
总之，配抗体的buffer里除了抗体本身不要有其他蛋白，这样保质期就长了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 不要加那个东西，
那个东西会抑制HRP
如果不小心加了，必须注意用普通的PBST or TBST 多洗几次（最少5次），
洗液里和二抗里切切不可再加sodium azide |
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r******k
发帖数: 446 | 20 各位大神 请教个问题，
小弟要要check一个蛋白的磷酸化水平，
1. block 膜的时候 能用5%的milk 吗？ 还是必须要用5%的BSA？
2. incubate 一抗的时候 还需要dilute在5%的BSA吗？ 还是直接TBST也行？
多谢！！ |
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h*******o
发帖数: 4884 | 21 个人经验不是
cell signal的抗体一般product sheet上面都建议BSA
我一直都用 pierce的superblock 目前为止还没有遇到做不出来而BSA做出来的情况
in cu ba te的时候建议用block 的配 直接用tbst 杂带可能会多
一些 |
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r******k
发帖数: 446 | 22 好 谢谢
我做了 我的抗体是识别特异位点的一个tyr磷酸化抗体，用牛奶block， 然后直接
tbst incubate一抗，没啥问题。 |
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M******g
发帖数: 152 | 23 After glycine 0.1 M pH2.5 striping twice, I normally just use TBST to
briefly rinse the membrane twice, and use 5% milk or 3% BSA to re-block the
membrane. |
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