D****s
发帖数: 5 | 1 要表达一个全长40KD的蛋白，用的是pET32a+ vector. 转化入BL21(DE3) bacteria.
Western 显示full-length protein只有大约10%， 主要被降解成2条非常强的band.
而只表达这个蛋白的fragment（大约一半，20KD), 就没有蛋白降解的发生。
请问有什么好的建议？谢谢 |
b*******r
发帖数: 179 | 2 well, if you are doing crystallography then 20kda protein is fine
unless the part that's getting degraded is something they're interested in
looking at
if you wants to save it, i would try coexpressing the protein with a
binding partner
that binds the region that's getting degraded
hopefully the binding partner can stabilize it
so that it won't get degraded |
b*******r
发帖数: 179 | 3 the other thing is
you can try coexpressing the same protein
but use truncations
like you expresses the 20kd fragment
and then expresses the other 20kd fragment as well
and put them together
some times if the two domains are tightly linked
and just have a small flexible linker
some times if u just coexpress them together
they end up touching each other enough
in all honesty
if you doing crystallography
he should just do the two fragments and put them in the xtal tray
as long as you wait for the |
b******n
发帖数: 4225 | 4 如果加足了蛋白酶抑制剂和低温操作还是这样的话
该蛋白有自我催化降解功能？
【在 D****s 的大作中提到】
: 要表达一个全长40KD的蛋白，用的是pET32a+ vector. 转化入BL21(DE3) bacteria.
: Western 显示full-length protein只有大约10%， 主要被降解成2条非常强的band.
: 而只表达这个蛋白的fragment（大约一半，20KD), 就没有蛋白降解的发生。
: 请问有什么好的建议？谢谢
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D****s
发帖数: 5 | 5 此蛋白是一个ubiquitin E3 ligase. 加了蛋白酶抑制剂并且是低温操作，还是绝大部
分蛋白被降解。感觉降解应该发生在收菌以前。我需要表达纯化全长的此蛋白。
请问这种情况，换一个E.coli host strain 来表达会有效果吗？ |
j*********n
发帖数: 168 | 6 我以为2、3楼朋友说的策略不见得有效。也很难找到可以结合后保护断裂位点的合适蛋
白，共转什么的，也很麻烦。我们实验室也用过类似的办法，不太奏效。
我觉得可行的一是你看一下大概什么位置断掉的，突变一下相应的氨基酸；二是可以换
其他的表达系统，就是不用细菌的，比如昆虫细胞。
如果一定要获得全长表达的蛋白，再完成后续研究，有时是很困难的。
你在大量表达前没有做小的test么？什么时候降解的，应该是可以在test里看出的啊。
如果test的时候就得不到全长表达的蛋白，还做后面的大量表达有什么意义呢？呵呵……
即便是在大量表达，你的裂解样品，过柱液，清洗液，洗脱液，纯化后的，都跑SDS-
PAGE了么？从开始就降解的，还是过程中呢？感觉降解发生在哪里，呵呵，我相信女士
的感觉一般很准，但咱这是科学研究，不是猜猜看，你说呢？ |
b******n
发帖数: 4225 | 7 你试过低温表达了吗？比如说30度或者25度
温度低可能蛋白降解会慢一点
另外表达的时候可以尝试加3%左右的乙醇看看效果
你是不是纯化之后过柱再做的western？
如果没问题，能否将序列和western电泳图（最好有marker）发给我看看
s****[email protected]
反正蛋白纯化是门艺术，不同蛋白纯化方法不同
多试试看运气吧
【在 D****s 的大作中提到】
: 此蛋白是一个ubiquitin E3 ligase. 加了蛋白酶抑制剂并且是低温操作，还是绝大部
: 分蛋白被降解。感觉降解应该发生在收菌以前。我需要表达纯化全长的此蛋白。
: 请问这种情况，换一个E.coli host strain 来表达会有效果吗？
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g*****n
发帖数: 241 | |
