K**********e
发帖数: 188 | 1 1 养悬浮的细胞系，由于疏忽，培养基都有点变黄了，不过也不是全黄，红中带黄或者
偏黄。这样的培养基是不是pH值变
化了，养出来的细胞已经在酸性环境了，也不适合做后面的实验了？
2 合成的引物，5端带不带磷酸基？要是合成几十个bp正向和反向互补序列带黏性末端
，退火，连到载体去，要不要先用T4
kinase处理加上磷酸基团？
很简单的问题，请指教下。谢谢。 |
b*****e
发帖数: 85 | 2 试着回答：
1。 是的，PH 肯定不对了
2. 一般不带的，不过买的时候可以要求吧 |
s******y
发帖数: 28562 | 3
看你用的是什么细胞。大部分细胞都不在乎这么一点改变，只要不是黄的很厉害，
都还是可以用的。 你最好问一下实验室里面的人
如果你不额外要求，就是不带磷酸集团的。但是载体上一般都是有带磷酸基的呀！
（除非你特别用磷酸酶处理了），所以没有必要另外再加了。
如果你需要的话，可以定购的时候要求他们加上磷酸基。
【在 K**********e 的大作中提到】
: 1 养悬浮的细胞系，由于疏忽，培养基都有点变黄了，不过也不是全黄，红中带黄或者
: 偏黄。这样的培养基是不是pH值变
: 化了，养出来的细胞已经在酸性环境了，也不适合做后面的实验了？
: 2 合成的引物，5端带不带磷酸基？要是合成几十个bp正向和反向互补序列带黏性末端
: ，退火，连到载体去，要不要先用T4
: kinase处理加上磷酸基团？
: 很简单的问题，请指教下。谢谢。
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K**********e
发帖数: 188 | 4 谢谢上面的和sunnyday。
1 哦哦。那还好，细胞培养基有点黄，但还是有点红。因为是悬浮细胞，稀释可以吗，
还是最好离心下来再用新鲜的培养基悬浮？
2 嗯嗯，原来载体拿限制内切酶切了的话就上带有磷酸基了啊。我没有用磷酸酶处理载
体。我合成的时候没有要求，就是当成引物让公司直接合成的。那我用T 4 PNK kinase
又处理了我的要插入载体的双链DNA片段，是不是就多了一个磷酸，反而连接不上去了呢？
可是指导我做实验的senior postdoc让我用T4 PNK处理，他也知道我是公司直接合成的
引物。这个postdoc以前做过很多这样的载体，应该很清楚呀。
其实我做的是合成hairpin DNA，克隆进载体，准备做sh RNA knock down。 |
i*****l
发帖数: 51 | 5 艳阳天MM的回答准确，就按她的建议去做。 T4 PNK是用来末端磷酸化的，公司合成的
REGULAR OLIGO都是-OH末端， 直接和载体连接就可了
kinase
了呢？
【在 K**********e 的大作中提到】
: 谢谢上面的和sunnyday。
: 1 哦哦。那还好，细胞培养基有点黄，但还是有点红。因为是悬浮细胞，稀释可以吗，
: 还是最好离心下来再用新鲜的培养基悬浮？
: 2 嗯嗯，原来载体拿限制内切酶切了的话就上带有磷酸基了啊。我没有用磷酸酶处理载
: 体。我合成的时候没有要求，就是当成引物让公司直接合成的。那我用T 4 PNK kinase
: 又处理了我的要插入载体的双链DNA片段，是不是就多了一个磷酸，反而连接不上去了呢？
: 可是指导我做实验的senior postdoc让我用T4 PNK处理，他也知道我是公司直接合成的
: 引物。这个postdoc以前做过很多这样的载体，应该很清楚呀。
: 其实我做的是合成hairpin DNA，克隆进载体，准备做sh RNA knock down。
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p******i
发帖数: 1092 | 6 查你用的載體/系統的MANUAL，裡面應該寫了
我以前用過一個什麼shRna的KIT，裡面要求加P；載體是KIT提供的，我忘記了是不是2個不同的酶切位點
引物5'带磷酸基需要另外加錢
而且de-salt quality的primer貌似還不能加P，需要高純度的primer，還要加錢
你問的那個人難道是要給LAB省錢？
【在 K**********e 的大作中提到】
: 谢谢上面的和sunnyday。
: 1 哦哦。那还好，细胞培养基有点黄，但还是有点红。因为是悬浮细胞，稀释可以吗，
: 还是最好离心下来再用新鲜的培养基悬浮？
: 2 嗯嗯，原来载体拿限制内切酶切了的话就上带有磷酸基了啊。我没有用磷酸酶处理载
: 体。我合成的时候没有要求，就是当成引物让公司直接合成的。那我用T 4 PNK kinase
: 又处理了我的要插入载体的双链DNA片段，是不是就多了一个磷酸，反而连接不上去了呢？
: 可是指导我做实验的senior postdoc让我用T4 PNK处理，他也知道我是公司直接合成的
: 引物。这个postdoc以前做过很多这样的载体，应该很清楚呀。
: 其实我做的是合成hairpin DNA，克隆进载体，准备做sh RNA knock down。
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K**********e
发帖数: 188 | 7 有点不明白了。公司合成的常规引物5端是OH，那载体的3端切出来不也是OH，那怎么能
连得上呢？
只有在引物的5端做了磷酸化，加上P，才能和载体的OH连上啊？
哎，我真是太弱了 。。。期盼继续解疑释惑
的
【在 i*****l 的大作中提到】
: 艳阳天MM的回答准确，就按她的建议去做。 T4 PNK是用来末端磷酸化的，公司合成的
: REGULAR OLIGO都是-OH末端， 直接和载体连接就可了
:
: kinase
: 了呢？
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s******y
发帖数: 28562 | 8 DNA are double helix
On the vector part there will be one 5'-end and one 3'-end on each side.
If only one end has the phosphate group, it will be enough for the ligation
to work. The nicked end can be patched up later inside the bacteria.
In some case, in order to increase the efficiency of transformation, people
use T4 ligase to put the phosphate group on the two 5'-ends of the oligo. I
think this is why your senior in the lab ask you to do that. In this case,
you should follow his/her directio
【在 K**********e 的大作中提到】
: 有点不明白了。公司合成的常规引物5端是OH，那载体的3端切出来不也是OH，那怎么能
: 连得上呢？
: 只有在引物的5端做了磷酸化，加上P，才能和载体的OH连上啊？
: 哎，我真是太弱了 。。。期盼继续解疑释惑
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: 的
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