m***o
发帖数: 272 | 1 有什么原因吗？
做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物如果用one step,竟然一点不能得到产物，但
如果仅用来做PCR，就可以得到很干净的条带。所以想在one step 里加random primer
来RT，但是好像很多kit都是只用gene 的primer来RT。不知有啥讲究。
谢谢！ |
w******n
发帖数: 767 | 2 没啥讲究吧，只不过用不着random了。我有时检测多个gene，用oligo(dt),做完反转录
，取RT产物可以检多个gene，没有问题。
primer
【在 m***o 的大作中提到】
: 有什么原因吗？
: 做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物如果用one step,竟然一点不能得到产物，但
: 如果仅用来做PCR，就可以得到很干净的条带。所以想在one step 里加random primer
: 来RT，但是好像很多kit都是只用gene 的primer来RT。不知有啥讲究。
: 谢谢！
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m***o
发帖数: 272 | 3 谢谢ｗａｋｅｓｍａｎ回复。
就是说你用的还是２step RT-PCR了？我现在还是需要做ｏｎｅ ｓｔｅｐ，就想试着
往ｋｉｔ里add random primer是不是可以有特异条带生成。 |
n********k
发帖数: 2818 | 4 why u "have to" do one step RT-PCR? I am pretty curious...BTW, how long is your amplicon? for QPCR, best be below 150bp, something around 50-100bp would be good...virtually every pair works if one uses a reasonable software and pick the top choices...I use IDT's website to design it...
【在 m***o 的大作中提到】
: 谢谢ｗａｋｅｓｍａｎ回复。
: 就是说你用的还是２step RT-PCR了？我现在还是需要做ｏｎｅ ｓｔｅｐ，就想试着
: 往ｋｉｔ里add random primer是不是可以有特异条带生成。
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h*******o
发帖数: 4884 | 5 没有完全看懂楼主的意思 , 个人理解
所有的One step RT-PCR kit都不可能用gene specific primer来做RT这一步
都是用的oligodT之类的primer来做RT,然后在接着标准的PCR而已
只不过对Taq的要求高一点而已,需要HotStart Taq
user自己加入自己的specific primer for gene of interest.
整个mixture其实就是先RT在PCR, 一般Protocol都要求42度1小时RT,然后直接65赌灭活,再开始PCR的cycle.
我以前用过很多One-step RT PCR,如果不出条带一般是自己的引物的问题
至于One-step realtime PCR 没试过
primer
【在 m***o 的大作中提到】
: 有什么原因吗？
: 做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物如果用one step,竟然一点不能得到产物，但
: 如果仅用来做PCR，就可以得到很干净的条带。所以想在one step 里加random primer
: 来RT，但是好像很多kit都是只用gene 的primer来RT。不知有啥讲究。
: 谢谢！
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w******n
发帖数: 767 | 6 用的就是one step kit，我的kit是先45分钟，然后正常pcr cycle, 这45分钟就是在RT
,所以我用oligo dt到这一步就停下，后面用这个做模板pcr.加random应该没问题，我
一次加过两种引物。试一下就行，也不费劲，不过你的没有条带，不一定是这个原因。
【在 m***o 的大作中提到】
: 谢谢ｗａｋｅｓｍａｎ回复。
: 就是说你用的还是２step RT-PCR了？我现在还是需要做ｏｎｅ ｓｔｅｐ，就想试着
: 往ｋｉｔ里add random primer是不是可以有特异条带生成。
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l**********1
发帖数: 5204 | 7 OMG
LZ used degenerated primer for cDNA single strand synthesis
R U Seriously? an amateur molecular biologist LZ?
Please go to
//www.protocol-
online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/Reverse_Transcription__RT____cDNA_Synthesis/index.html
RT reaction is also called first strand cDNA synthesis. Three types of primers can be used for RT reaction:
oligo (dT) primers, random (hexamer) primers and gene specific primers with each having its pros and cons.
or
/media.affymetrix.com/support/technical/usb/proto/78350a.pdf
//www.affymetrix.com/estore/browse/brand/usb/product.jsp?productId=131322
otherwise
you or your PI try this cutting edge new protocol random qRT-PCR?
if it worked submit manuscript to Nature Methods or similar level journal?
if later why not try RNA-Seq
//www.ii.uib.no/~inge/inf389-2010/nihms229948.pdf
-----
BTW did you full sequencing your that PCR得到很干净的条带
Why does it belong to one anticlimax PCR products?
for do confirmation:
first you can cut that band and sub TA cloning to one vector
transforming and expression
then pick blue colony do sequencing.
detail protocol please go to:
//hcgs.unh.edu/protocol/basic/Cltaclone.html
or
//www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/minelutegelextractionkit.aspx
>
回复]
发信人: magno (mag), 信区: Biology
标 题: 为什么one step RTPCR 一般都是用gene specific primer 而不是random oligomers
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Feb 15 11:08:21 2012, 美东)
有什么原因吗？
做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物如果用one step,竟然一点不能得到产物，但
如果仅用来做PCR，就可以得到很干净的条带。
---
your amplicon? for QPCR, best be below 150bp, something around 50-100bp
would be good...virtually every pair works if one uses a reasonable software
and pick the top choices...I use IDT's website to design it...
【在 n********k 的大作中提到】
: why u "have to" do one step RT-PCR? I am pretty curious...BTW, how long is your amplicon? for QPCR, best be below 150bp, something around 50-100bp would be good...virtually every pair works if one uses a reasonable software and pick the top choices...I use IDT's website to design it...
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w******n
发帖数: 767 | 8 从哪儿看出来LZ用了degenerated primer, random?
Synthesis/index.html
primers can be used for RT reaction:
with each having its pros and cons.
【在 l**********1 的大作中提到】
: OMG
: LZ used degenerated primer for cDNA single strand synthesis
: R U Seriously? an amateur molecular biologist LZ?
: Please go to
: //www.protocol-
: online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/Reverse_Transcription__RT____cDNA_Synthesis/index.html
: RT reaction is also called first strand cDNA synthesis. Three types of primers can be used for RT reaction:
: oligo (dT) primers, random (hexamer) primers and gene specific primers with each having its pros and cons.
: or
: /media.affymetrix.com/support/technical/usb/proto/78350a.pdf
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 from his/her sentence
>做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物 mRNA as template 用one step RTPCR, then 自己上网设计的引物 PCR
竟
然一点不能得到产物
but with direct genomic DNA as template 自己上网设计的引物 可以得到很干净的条带
then you can IMAGE that---
because he/she did not have the full 3' UTR end that target full sequence information
so he/she used degenerated primer+oligo T tails for one-step qRTPCR
otherwise without below his/her 0F paste.
----
【在 w******n 的大作中提到】
: 从哪儿看出来LZ用了degenerated primer, random?
:
: Synthesis/index.html
: primers can be used for RT reaction:
: with each having its pros and cons.
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l**********1
发帖数: 5204 | 10 if your target mRNA its 3' UTR super long (over several kp) tor before the stop codon high GC rich region
then you can only get with normal qRTPCR then PCR whole 3RACE PCR products.
This case please try another method:
: ligation-anchored PCR cloning
一句话就是用内切酶对应的人工引物锚定: 3'端 做人工锚定引物PCR
mRNA with a primer (3'-poly
(dT)17 with an anchor sequence at its 5'end, then qRTPCR then PCR sub cloning... sequencing.
References:
//genome.cshlp.org/content/4/1/19.full.pdf
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/
//aem.asm.org/content/75/6/1552.abstract
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14660366
primer
【在 m***o 的大作中提到】
: 有什么原因吗？
: 做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物如果用one step,竟然一点不能得到产物，但
: 如果仅用来做PCR，就可以得到很干净的条带。所以想在one step 里加random primer
: 来RT，但是好像很多kit都是只用gene 的primer来RT。不知有啥讲究。
: 谢谢！
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w******n
发帖数: 767 | 11 one step rt-pcr用的就是 gene specific primer RT,说明书里通常说不推荐用random
或oligo(dt).
活,再开始PCR的cycle.
【在 h*******o 的大作中提到】
: 没有完全看懂楼主的意思 , 个人理解
: 所有的One step RT-PCR kit都不可能用gene specific primer来做RT这一步
: 都是用的oligodT之类的primer来做RT,然后在接着标准的PCR而已
: 只不过对Taq的要求高一点而已,需要HotStart Taq
: user自己加入自己的specific primer for gene of interest.
: 整个mixture其实就是先RT在PCR, 一般Protocol都要求42度1小时RT,然后直接65赌灭活,再开始PCR的cycle.
: 我以前用过很多One-step RT PCR,如果不出条带一般是自己的引物的问题
: 至于One-step realtime PCR 没试过
:
: primer
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h*******o
发帖数: 4884 | 12 了解了
原来我一直以为one step RT-PCR的master mix里面有oligo dT之类,用来做RT step
然后user 自己加入的gene specific primer只是用来扩增用的
hoho, 傻兮兮的用了好几年都不知道原理
谢谢!
random
【在 w******n 的大作中提到】
: one step rt-pcr用的就是 gene specific primer RT,说明书里通常说不推荐用random
: 或oligo(dt).
:
: 活,再开始PCR的cycle.
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 Your original thought is regular 3' RACE
oligo dT its target is poly (A) tail
but for super long 3' UTR (over 3 kp) mRNA that regular 3' RACE does not work
from even you do not know the extension time for that PCR before your did
Northern Blotting or similar experiment for knowing the full length of 3' UTR region.
【在 h*******o 的大作中提到】
: 了解了
: 原来我一直以为one step RT-PCR的master mix里面有oligo dT之类,用来做RT step
: 然后user 自己加入的gene specific primer只是用来扩增用的
: hoho, 傻兮兮的用了好几年都不知道原理
: 谢谢!
:
: random
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w******n
发帖数: 767 | 14 其实我也不知道你在说啥，他的primers是work的，下游primer应该不会设计在3'UTR。
【在 l**********1 的大作中提到】
: Your original thought is regular 3' RACE
: oligo dT its target is poly (A) tail
: but for super long 3' UTR (over 3 kp) mRNA that regular 3' RACE does not work
: from even you do not know the extension time for that PCR before your did
: Northern Blotting or similar experiment for knowing the full length of 3' UTR region.
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 楼主 没有确定的可以general qRTPCR的两组碱基序列才会问这个贴的吧
有时候就得用特殊的anchor adaptor ligation qRTPCR and relative PCRs
details steps 请看图
snap copied and pasted from
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14660366
NB: for which kind of restriction enzyme that fit to your target,
case by case just by your PCR cycling and Gel Image and sequencing cycles again and again
and your fate probability.
【在 w******n 的大作中提到】
: 其实我也不知道你在说啥，他的primers是work的，下游primer应该不会设计在3'UTR。
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l**********1
发帖数: 5204 | 16 oligo dT 没错 如target gene 只有一段很短的碱基序列(<120bp) 已知
而没有任何其上游5' 或下游3'的序列信息
只能用oligo dT qRTPCR 从poly A tail 揪出那条mRNA to single strand cDNA
then to double strand cDNA the 附加带酶切位点的各种adapter
再用那些人工加入的带确定碱基序列的 adapter 5' to 3' 对应的 反链 3' to 5' 的引物
PCR cycling
具体步骤请看图:
snap copied and pasted from
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/
【在 h*******o 的大作中提到】
: 了解了
: 原来我一直以为one step RT-PCR的master mix里面有oligo dT之类,用来做RT step
: 然后user 自己加入的gene specific primer只是用来扩增用的
: hoho, 傻兮兮的用了好几年都不知道原理
: 谢谢!
:
: random
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w******n
发帖数: 767 | 17 你想复杂了，lz这个是已知基因，而且他有序列。one-step qRT-PCR是用下游引物起始
合成CDNA第一链，但是他的引物不work，想加入random合成第一链，这个做realtime可
能有问题，random会产生非特异带，影响定量，建议楼主试别的引物，或者两步RT-PCR。
的引物
【在 l**********1 的大作中提到】
: oligo dT 没错 如target gene 只有一段很短的碱基序列(<120bp) 已知
: 而没有任何其上游5' 或下游3'的序列信息
: 只能用oligo dT qRTPCR 从poly A tail 揪出那条mRNA to single strand cDNA
: then to double strand cDNA the 附加带酶切位点的各种adapter
: 再用那些人工加入的带确定碱基序列的 adapter 5' to 3' 对应的 反链 3' to 5' 的引物
: PCR cycling
: 具体步骤请看图:
: snap copied and pasted from
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 了解 老大
Ps: LZ 啥时worked 回帖说一下啊
PCR。
【在 w******n 的大作中提到】
: 你想复杂了，lz这个是已知基因，而且他有序列。one-step qRT-PCR是用下游引物起始
: 合成CDNA第一链，但是他的引物不work，想加入random合成第一链，这个做realtime可
: 能有问题，random会产生非特异带，影响定量，建议楼主试别的引物，或者两步RT-PCR。
:
: 的引物
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