H**1
发帖数: 34 | 1 小弟设计了一些primer，用来做RT-QPCR，检测几个基因的mRNA在WT和KD细胞的变化。
设计好了primer，小弟先在WT和KO细胞测试引物的efficiency。
小弟把cDNA稀释成1：5，1：10，1：20，1：40，然后做QPCR，计算efficiency。
结果发现同一个引物，在两个细胞系的efficiency居然不同。
请教这是为什么？
着急。 | h******y
发帖数: 351 | 2 First, you dilution range is not big enough (8x) to get an accurate estimate
of the PCR efficiency.
Second, your samples are different, even though they are all cDNA. Keep in
mind that they come from different cells.
【在 H**1 的大作中提到】
: 小弟设计了一些primer，用来做RT-QPCR，检测几个基因的mRNA在WT和KD细胞的变化。
: 设计好了primer，小弟先在WT和KO细胞测试引物的efficiency。
: 小弟把cDNA稀释成1：5，1：10，1：20，1：40，然后做QPCR，计算efficiency。
: 结果发现同一个引物，在两个细胞系的efficiency居然不同。
: 请教这是为什么？
: 着急。
| A******y
发帖数: 2041 | 3 RT-PCR linearity is 5 fold dilution for 5 times i.e. 1/5, 1/25, 1/125, 1/625
, 1/(625*5). There is a possibility that your target mRNA fall out of you
linear range due to different in absolute mRNA copies.
【在 H**1 的大作中提到】
: 小弟设计了一些primer，用来做RT-QPCR，检测几个基因的mRNA在WT和KD细胞的变化。
: 设计好了primer，小弟先在WT和KO细胞测试引物的efficiency。
: 小弟把cDNA稀释成1：5，1：10，1：20，1：40，然后做QPCR，计算efficiency。
: 结果发现同一个引物，在两个细胞系的efficiency居然不同。
: 请教这是为什么？
: 着急。
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